转录生长因子-β1对牛角膜基质体外三维培养模型中胶原构筑的影响

摘要

背景：胶原纤维结构破坏是导致多种疾病发生发展的主要原因，包括角膜瘢痕形成。研究胶原纤维的构筑，深入理解角膜瘢痕形成的分子机制，对寻找减少角膜瘢痕化及防治角膜盲具有重要意义。在角膜基质损伤修复过程中，主要的病理性改变是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）纤维化，而ECM的异常沉积又以胶原纤维合成异常为主。体外三维培养克服了二维培养难以研究ECM结构的局限性，是研究ECM的有效方法。我们的前期研究成功构建了牛角膜基质细胞体外Pellet三维培养模型，添加转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）于该模型中，可诱导角膜基质细胞在mRNA水平和蛋白水平上表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ，ColⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ，ColⅢ)、纤维链接蛋白（fibronectin，FN）。本研究应用该培养体系探讨TGF-β1对胶原合成及构筑的影响，进一步理解角膜基质瘢痕化的形成。
　　目的：构建牛角膜基质细胞体外Pellet三维培养模型，评估TGF-β1对该培养体系中角膜基质细胞胶原纤维的合成情况（表达量及比例），及评估TGF-β1是否影响该模型新合成胶原的构筑（直径及空间排列）。
　　方法：利用体外Pellet三维培养模型培养原代牛角膜基质细胞，根据培养液添加TGF-β1质量浓度不同，实验分为低浓度组(0.5 ng/ml TGF-β1)和高浓度组(1.0 ng/ml TGF-β1)。于实验第2w、3w、4w时间点，通过免疫荧光化学法检测细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白的表达;培养2w、4w时于透射电镜下观察胶原纤维的形态、走向及空间排列情况;同时应用Image ProPlus6.0软件测量ColⅠ和ColⅢ蛋白的相对表达量，及4w时胶原纤维的直径大小，并对其测量结果进行统计学分析。
　　结果：(1)随着TGF-β1浓度的增加或培养时间的延长，ColⅠ和ColⅢ蛋白的合成均逐渐增加，具有浓度-相关性及时间-效应关系;(2)无论是高浓度组还是低浓度组，ColⅢ/ColⅠ的比值均下调，呈时间依赖趋势;且4w时ColⅢ/ColⅠ的比值显著低于2w;各时间点相比较，高浓度组的比值低于低浓度组的。(3)透射电镜图片显示在培养4w后胶原纤维大量合成，且排列紊乱，高浓度组较为明显;(4)统计学分析结果示4w时高浓度组纤维直径明显较低浓度组粗大，具有浓度-效应关系。
　　结论：含0.5 ng/ml或1.0 ng/ml的TGF-β1均能促进Pellet培养模型中角膜基质细胞合成ColⅠ、ColⅢ蛋白，引起ColⅢ/ColⅠ比例失调，呈时间-剂量依赖趋势。TGF-β1介导合成的胶原纤维直径较粗、排列紊乱，呈浓度-效应关系。TGF-β1影响该培养体系胶原纤维的合成及构筑。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

6 结论

参考文献

附录

综述 转化生长因子-β促角膜基质瘢痕形成的分子机制

致谢

攻读学位期间发表的学术论文