骨保护素基因多态性与椎间盘退变的相关性研究及兔椎间盘退变模型的研究

摘要

第一部分 OPG基因多态性与椎间盘退变的相关性研究
　　目的：椎间盘退变是导致影响人们生活质量的众多疾病之一，其可表现为下腰痛、椎间盘突出及腰椎管狭窄。其确切的病理机制还不是十分清楚，但是基因和环境因素起了很大的作用。骨保护素是肿瘤坏死因子超受体家族中的一种含有401个氨基酸残基的细胞因子受体的糖蛋白，同时也是一种破骨细胞形成抑制因子。它主要由成骨细胞合成，但在其他的器官和组织中也有表达，包括心脏、血管壁、肺脏、肾脏、骨组织。研究认为OPG基因的调控对骨量及骨折，骨质疏松症和骨关节炎的风险的增加具有较大的影响。但是缺乏对OPG基因与椎间盘退变之间联系的研究。本部分研究的目的是探讨OPG基因3种常见位点多态性950T/C(rs2073617)、1181G/C(rs2073618)和163A/G(rs3102735)及OPG蛋白表达水平与椎间盘退变的关联。
　　方法：选择2013年1月到2014年5月于该院就诊的200例椎间盘退变患者作为病例组，200例正常健康人作为对照组。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测研究对象OPG基因rs2073617、rs2073618和rs3102735位点基因型和单倍型频率分布情况，并运用采用酶联免疫法（ELISA）检测血清OPG水平。采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。
　　结果：病例组和对照组OPG基因rs2073617多态性的等位基因和基因型频率差异具有统计学意义，携带C等位基因可能会增加椎间盘退变风险,但两组rs2073618和rs3102735多态性等位基因和基因型频率均无统计学差异。携带OPG基因rs2073617多态性3种不同基因型（TT、TC和CC）椎间盘退变患者的血清OPG水平均明显高于健康对照组。然而，携带rs3102735和rs2073618多态性不同基因型患者的血清OPG水平与对照组相比均无统计学差异。单倍型分析结果显示，OPG基因G-T-G单倍型可能是椎间盘退变的保护性因素，而G-C-G单倍型可能为椎间盘退变的危险因素。Logistic回归分析结果表明：高血清OPG水平与椎间盘退变发生风险呈正相关，而T-C-A、T-G-A和T-G-G单倍型与椎间盘退变发生风险呈负相关。
　　结论：OPG基因rs2073617多态性可能与椎间盘退变有关，但rs2073618和rs3102735多态性可能不是增加椎间盘退变易感性的主要危险因素。此外，OPG基因T-C-A、T-G-A和T-G-G单倍型可能是椎间盘退变的保护性因素，高血清OPG水平则可能是椎间盘退变的危险因素。
　　第二部分不同型号穿刺针经皮微创穿刺对兔腰椎间盘影响的实验研究
　　目的：腰椎间盘退变导致的腰背部疼痛或者是下肢放射痛已经是现代人的一种常见病，严重的影响了患者的工作和生活，并且消耗了大量的医疗资源。椎间盘退变是一个非常复杂的过程，并且是由多种因素共同参与的一个慢性过程。但是，目前对于椎间盘退变的始动因素及确切的病理生理机制尚不清楚。所以有必要进行更加深入的研究，目的是阻止或者延缓椎间盘退变的发生与进展。因此，建一个理想的椎间盘退变的动物模型，对深入研究椎间盘退变的始动因素及确切的病理生理机制具有非常重要的作用。同时，一个理想的椎间盘退变的动物模型有利于研究者们准确、有效的评价各种不同的干预方式对椎间盘退变的影响，能够对临床上预防及治疗人椎间盘退变提供有意义的基础研究结果，指导临床上对椎间盘退变的预防与治疗。但是目前许多建立椎间盘退变的动物模型的方法都存在如创伤较大、感染率高、可重复性差等等问题。本研究的目的是寻找一种简单、有效、重复性高的建立椎间盘退变的动物模型的方法。
　　方法：健康成年新西兰大白兔24只，全身麻醉后采用18G、20G、22G大小穿刺针在C型臂X线机的辅助下经皮分别穿刺L3/4、L4/5、L5/6椎间盘，L6/7椎间盘作为对照组不进行穿刺。所有实验动物穿刺术前完成腰椎X线及MRI检查，穿刺术后4周复查腰椎X线及MRI。在X线检查结果上比较穿刺术前与术后的目标椎间盘高度指数的变化，MRI结果采用改良后的Piffimann椎间盘评分评估穿刺术前与术后目标椎间盘信号的改变情况。术后4周时处死实验动物取各组椎间盘分别采用HE染色、Masson染色、Safranin O染色观察各组椎间盘组织的变化。Ⅱ型胶原免疫组化染色观察各组髓核细胞Ⅱ型胶原的表达。采用统计学软件22.0进行单因素方差分析和双向有序卡方检验。P＜0.05被认为有统计学意义。
　　结果：24只新西兰大白兔均顺利完成手术，术中、术后未出现死亡、瘫痪及伤口感染的情况。术前及术后X线片结果显示术后4周时对照组、18G穿刺组、20G穿刺组、22G穿刺组各组间DHI％无显著性差异。术前及术后4周时腰椎MRI检查结果显示术前兔腰椎MRI T2加权像各个腰椎间盘均呈高信号，术后4周兔腰椎间盘MRI T2加权像显示18G穿刺针穿刺后的L3/4椎间盘呈现明显低信号改变，而20G穿刺针穿刺后的L4/5椎间盘、22G穿刺针穿刺后的L5/6椎间盘及对照L6/7椎间盘仍然呈现高信号。改良后的Piffimann椎间盘分级法将各组结果进行分级，采用双向有序行×列表的x2检验计算出各组分级差异有统计学意义，说明椎间盘退变程度与穿刺针的大小存在线性相关关系。HE染色显示18G组髓核细胞数量明显减少，20G组髓核细胞数量稍减少，22G组和对照组髓核细胞数量均较多。Masson染色显示18G组纤维环各层间的裂隙明显增多，20G组纤维环各层间裂隙稍有增多，对照组和22G组纤维环各层排列均匀，缝隙少。Safranin O染色显示对照组和22G组髓核内蛋白多糖表达较20G组和18G组多，20G组次之，18G组表达最少。Ⅱ型胶原免疫组化染色显示18G和20G组兔髓核细胞合成分泌Ⅱ型胶原能力较22G组和对照组明显降低，差异有统计学意义。
　　结论：经皮微创穿刺兔腰椎间盘制作椎间盘退变动物模型是安全的、可重复性高。使用18G和20G的穿刺针经皮微创穿刺兔腰椎间盘能够造成椎间盘的退变，并且18G的穿刺针经皮穿刺造成椎间盘退变的程度更严重。22G的穿刺针经皮微创穿刺兔腰椎间盘没有造成椎间盘的退变。本研究为椎间盘退变机制和再生的研究提供一种理想的动物椎间盘退变模型。