PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在右美托咪定逆转异丙酚神经毒性中的作用

摘要

目的:
　　观察不同剂量右美托咪定对异丙酚麻醉新生大鼠大脑的影响，并探讨PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的作用，以期为围术期婴幼儿麻醉用药提供参考。
　　方法:
　　新生7天的Sprague-Dawley大鼠（雌雄不分）250只，体重9～15g，随机分为10组(n=25):生理盐水组（N组）、脂肪乳剂组（F组）、DMSO1组（D1组）、DMSO2组（D2组）、100 mg/kg异丙酚组（P组）、25μg/kg右美托咪定+100 mg/kg异丙酚组（PD25组）、50μg/kg右美托咪定+100 mg/kg异丙酚组（PD50组）、75μg/kg右美托咪定+100 mg/kg异丙酚组（PD75组）、LY294002+75μg/kg右美托咪定+100 mg/kg异丙酚组(LYPD组)和TDZD-8+75μg/kg右美托咪定+100 mg/kg异丙酚组（TDPD组）。N组、F组及D2组分别腹腔注射生理盐水、脂肪乳剂及10％DMSO100μl; D1组侧脑室注射10％DMSO5μl;P组先腹腔注射异丙酚50 mg/kg，待大鼠有体动反应后，再追加50 mg/kg，总量为100 mg/kg; PD25、PD50、PD75组分别先腹腔注射右美托咪定25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg，30 min后再给予异丙酚（处理同P组）;LYPD组侧脑室注射LY29400225μg/5μl，30 min后腹腔注射右美托咪定75μg/kg，30 min后再给予异丙酚（处理同P组）;TDPD组腹腔注射TDZD-81 mg/kg，30 min后腹腔注射右美托咪定75μg/kg，30min后再给予异丙酚（处理同P组）。大鼠苏醒后1h，每组取5只大鼠动脉血行血气分析;另取10只大鼠断头取脑，提取新鲜海马组织总mRNA及总蛋白，采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PI3K、Akt、GSK-3β等基因mRNA的表达，免疫印迹法(Western blot)检测Akt、pAkt(ser473)、GSK-3β、pGSK-3β(ser9)等蛋白的表达;另取10只大鼠行脑灌注固定后制作脑组织切片，免疫荧光染色法(Immunohistofluorescence)检测海马细胞中pAkt(ser473)、pGSK-3β(ser9)等蛋白的表达及细胞定位，透射电镜(Transmission electron microscope)观察海马神经元超微结构的变化。
　　结果:
　　与N组比较，P组GSK-3β mRNA表达增高(P＜0.05)，LYPD组PI3K mRNA、Akt mRNA的表达和TDPD组GSK-3β mRNA的表达则降低(P＜0.05);与P组比较，LYPD组PI3K mRNA、Akt mRNA表达降低，PD75组、TDPD组GSK-3β mRNA的表达降低(P＜0.05)。与N组比较，P组、PD25组、PD50组、PD75组、LYPD组pAkt(ser473)蛋白和pGSK-3β(ser9)蛋白表达降低(P＜0.05);与P组比较，PD25组、PD50组、PD75组、LYPD组、TDPD组Akt蛋白、GSK-3β蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05），PD75组、TDPD组pAkt(ser473)蛋白表达升高(P＜0.05)，PD25组、PD50组、PD75组、TDPD组pGSK-3β(ser9)蛋白表达升高(P＜0.05)。与PD75组比较，LYPD组pAkt(ser473)蛋白和pGSK-3β(ser9)蛋白表达降低，TDPD组pGSK-3β(ser9)蛋白表达升高(P＜0.05)。与N组比较，P组、PD25组、PD50组、PD75组、LYPD组、TDPD组pAkt(ser473)/Akt比值降低(P＜0.05)，P组、PD25组、PD50组、LYPD组pGSK-3β(ser9)/GSK-3β比值降低(P＜0.05);与P组比较，PD75组、TDPD组pAkt(ser473)/Akt比值升高(P＜0.05)，PD25组、PD50组、PD75组、LYPD组、TDPD组pGSK-3β(ser9)/GSK-3β比值升高（P＜0.05）;与PD75组比较，LYPD组pAkt(ser473)/Akt和pGSK-3β(ser9)/GSK-3β比值降低（P＜0.05），而TDPD组pAkt(ser473)/Akt和pGSK-3β(ser9)/GSK-3β比值升高(P＜0.05)。免疫荧光显示:与N组比较，P组、PD25组、PD50组、LYPD组pAkt(ser473)蛋白表达降低(P＜0.05)，P组、PD25组、PD50组、PD75组、LYPD组pGSK-3β(ser9)蛋白表达降低(P＜0.05);与P组比较，TDPD组pGSK-3β(ser9)蛋白和pAkt(ser473)蛋白表达升高(P＜0.05)，PD75组pAkt(ser473)蛋白表达升高（P＜0.05），LYPD组pGSK-3β(ser9)蛋白表达降低(P＜0.05);与PD75组比较，LYPD组pAkt(ser473)和pGSK-3β(ser9)蛋白表达降低(P＜0.05)，TDPD组pGSK-3β(ser9)蛋白表达升高（P＜0.05）。透射电镜可见N组、F组、D1组、D2组神经元及突触结构正常，P组神经元及突触结构受到损伤、染色质边集、核固缩、线粒体空泡变性、嵴断裂，且突触小泡及突触后致密物明显减少，PD25组、PD50组、PD75组神经元及突触结构损伤随着右美托咪定剂量的增加而减轻，LYPD组神经元染色质凝聚并形成新月形小体、核膜部分溶解、线粒体明显空泡变性、突触结构明显受损，TDPD组神经元和突触形态基本正常。
　　结论:
　　异丙酚可导致发育期大鼠大脑海马神经元细胞损伤，右美托咪定可逆转异丙酚的神经毒性作用，其机制可能与激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 动物分组

3 实验方法

4 统计学处理

实验结果

1 一般情况及血气分析结果

2 RT-PCR检测结果

3 Western blot检测结果

4 免疫荧光结果

5 透射电镜观察海马神经元超微结构改变

讨论

结论

参考文献

附录

综述 右美托咪定围术期神经保护作用的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文