人uPA基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对CCL4诱导肝纤维化大鼠PI3K/AKT信号通路的影响

摘要

目的：探讨人uPA基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对CCL4诱导肝纤维化大鼠的治疗作用及对PI3K/AKT信号通路的影响。
　　方法： SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养,用携带人uPA基因的重组腺病毒（AduPA）转染 BMSCs。随机选取40只周龄6-8周的清洁级雄性SD大鼠，其中30只大鼠采用CCl4法建立肝纤维化模型，皮下注射40％ CCl4橄榄油混合液持续8周（每天一次）。正常对照组（10只）皮下注射等量橄榄油。在建模第4周末，将全部大平均分为四组，给予不同干预措施，分别为uPA-BMSCs组（大鼠尾静脉注射2×106AduPA转染的BMSCs）、 BMSCs组（大鼠尾静脉注射2×106BMSCs）、模型组（大鼠尾静脉注射等体积生理盐水）及正常对照组（大鼠尾静脉注射等体积生理盐水）。全部大鼠于第8周末处死，留取血清及肝组织标本。免疫组织化学法检测肝星状干细胞的凋亡和活化。Western blot法检测各组大鼠肝脏uPA蛋白及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达；RT-qPCR检查各组大鼠肝脏中MMP-2 mRNA、TIMP-1mRNA及COL-1 mRNA的表达
　　结果：
　　1、正常对照组中SD大鼠肝组织的α-SMA表达量极少，仅表达在中央静脉管壁、Disse间隙。模型组中大鼠肝细胞的α-SMA表达量显著增多，染色深度明显加深。而与模型组相比，uPA-BMSCs组和BMSCs组两组大鼠肝组织中α-SMA表达量均明显下降，且uPA-BMSCs组中α-SMA表达下降程度及着色深度较BMSCs组更为显著。
　　2、α-SMA和TUNEL免疫荧光双染色结果示：正常对照组中，因为几乎没有激活的肝星状细胞（α-SMA染红色阳性）。而与uPA-BMSCs组和BMSCs组相比较，模型组中Disse间隙见较多激活的肝星状细胞（α-SMA染红色阳性），但是发生凋亡的肝星状细胞数目明显较少（TUNEL+α-SMA双阳性）。而uPA-BMSCs组肝星状细胞凋亡的数目较BMSCs组多，双染色程度较BMSCs组深。
　　3、PI3K信号通路相关蛋白p-pi3k、p-AKT、p-GSK-3β蛋白检测结果显示：与Model组相比，uPA-BMSCs组和BMSCs组大鼠肝组织中p-pi3k、p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达量均明显减少，且uPA-BMSCs组中三种蛋白的表达量较BMSCs组更低。
　　4、RT-qPCR检测结果显示：与正常对照组相比，Model组大鼠肝组织中TIMP-1 MRNA、COL-1 mRNA的表达水平均明显升高,而MMP-2 MRNA的表达水平显著下降；而与Model组相比，uPA-BMSCs组和BMSCs组两组大鼠肝组织中TIMP-1 MNRA、COL-1 mRNA的表达水平均明显下降，而MMP-2 MNRA的表达水平显著升高；且uPA-BMSCs组中TIMP-1mRNA及COL-1 mRNA的表达表达水平下降程度及 MMP-2 MRNA升高程度较BMSCs组更为显著。
　　结论：人uPA基因修饰的BMSCs能有效预防和改善CCL4诱导的SD大鼠肝脏纤维化，抗肝纤维化机制也可能通过部分抑制PI3K/AKT信号通路的表达，并抑制HSC激活及促进其凋亡。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1 材料

2 实验方法

实验结果

1、4组SD大鼠的一般情况（CCL4造模期间）

2、小鼠肝脏病理学改变

3、免疫组化检测各组大鼠肝脏的a-SMA。

4、α-SMA 和TUNEL 免疫荧光双染色检测活化的肝星状细胞凋亡情况。

5、Western blot检测大鼠肝组织中PI3K、p-PI3K,AKT,p-AKT,GSK-3b及P-GSK-3b蛋白的表达

6、RT-PCR检测大鼠肝组织中MMP-2 mRNA、TIMP-1mRNA及COL-1 mRNA的表达

讨论

结论

参考文献

中英文对照汇总表

文献综述: HGF基因修饰骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文