3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对胃癌细胞SGC-7901及裸鼠胃原位移植瘤的影响及作用机制研究

摘要

背景和目的:胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常见的恶性肿瘤之一，近年来，虽然手术，化疗、放疗等取得了巨大的进步，但胃癌的5年生存率仍不理想。因此，寻找新的治疗靶点，提高患者生存率迫在眉睫。80年前Warburg发现恶性肿瘤细胞在有氧条件仍然更多依赖糖酵解来获取能量(Adenosinetriphosphate，ATP)。恶性肿瘤细胞的这一特点，为抗肿瘤药物的研究提供了一个靶点，即我们可以通过抑制糖酵解来杀灭肿瘤细胞。糖酵解反应中，己糖激酶(Hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶1(6-Phosphofructokinase-1，PFK-1)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)通过控制反应的关键步骤来调节糖酵解的速率。因此，如果药物能抑制这些关键酶的活性，则可以发挥抗肿瘤的作用。3-溴丙酮酸(3-BrPA)是一种强烷化剂，我们课题组及其他学者的研究均显示3-BrPA能通过结合HK的活性位点，从而抑制该酶的活性。柠檬酸钠(SCT)是一种常用于食品添加剂中的化合物，我们前期研究表明SCT能通过结合PFK-1的活性区域，抑制其活性。因此3-BrPA及SCT能通过抑制关键酶来控制糖酵解的速率，导致细胞供能减少。而研究已表明当肿瘤细胞发生能量枯竭时，可出现持续的DNA降解，线粒体膜通透性改变，引起细胞色素C(Cyt-C)的释放，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。通过对细胞凋亡通路的研究，能更好的揭示抗肿瘤药物作用机制。我们前期研究已经证明3-BrPA及SCT能抑制恶性胸膜间皮瘤及胃癌细胞增殖，但其具体作用的机制仍未完全阐明，尤其是腹腔内应用3-BrPA及SCT能否发挥其抗肿瘤效应及其作用机制国内外尚未见报道。因此，本实验首先使用人胃癌细胞株SGC-7901行3-BrPA及SCT的体外实验，然后建立裸鼠胃原位移植瘤模型，腹腔内注射3-BrPA及SCT行体内研究。希望为胃癌治疗的探索提供一些可供参考的研究依据。
　　第一部分、3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对胃癌细胞影响的体外实验实验
　　方法:培养人胃癌细胞SGC-7901，MTT法检测3-BrPA及SCT对其增殖影响，确定体外实验药物浓度。分8个实验组:空白对照组(Control组)，阳性对照组（5-FU组），3-BrPA低、中、高浓度组及SCT低、中、高浓度组。分别用药后，倒置显微镜观察胃癌细胞生长情况及形态改变;流式细胞技术检测细胞凋亡和周期;Hoechst33258染色法检测细胞凋亡，激光共聚焦显微镜及荧光探针法检测reactive oxygen species(ROS)产量;紫外比色法检测HK、PFK-1、PK活性，分光光度法检测ATP和乳酸(Lacticacid，LC)含量;Western blot(WB)检测凋亡基因蛋白的表达。
　　结果:
　　1.MTT实验结果:3-BrPA、SCT能呈时间及浓度依赖性抑制胃癌细胞生长，3-BrPA对SGC-7901的半数抑制浓度(IC50)在24h、48h分别为9.88±1.07μg/ml、5.97±0.95μg/ml。而SCT的IC50在24h、48h分别为6.47±0.87mg/ml、3.84±0.59mg/ml。
　　2.倒置显微镜观察结果:3-BrPA、SCT及5-FU可显著抑制胃癌细胞的增殖，随着3-BrPA、SCT浓度增加，活细胞数明显减少细胞排列稀疏，变圆，空白对照组细胞排列紧密，细胞呈多边形。
　　3.流式细胞技术检测结果:用药24 h、48 h后，3-BrPA组及SCT组细胞凋亡率随药物浓度增加或作用时间延长而显著增高(P＜0.05)。3-BrPA组中细胞凋亡率由15.60±1.83％增加至84.45±3.97％;SCT组中从19.31±1.89％增至88.34±5.22％。5-FU组细胞凋亡率在24h及48h分别为61.57±4.30％及92.64±4.15％。用药24h后，3-BrPA、SCT组及5-FU组中，G2/M期细胞数目明显增多(P＜0.05)，可见亚二倍体凋亡峰。5-FU组中，S期的细胞数也明显增加(P＜0.05)。
　　4.Hoechst33258染色结果:3-BrPA、SCT组及5-FU组可见凋亡细胞明显增多(P＜0.05)，表现为核固缩或崩解，细胞呈明显的亮蓝色，凋亡率随3-BrPA、SCT浓度的增高而增大(P＜0.05)，而空白对照组未见明显的凋亡细胞。
　　5.ROS产量检测结果:用药4h后，3-BrPA、SCT组及5-FU组中胞内ROS的产量较空白对照组明显增多(P＜0.05)，通过激光共聚焦显微镜观察，可见亮绿色细胞数量和荧光强度均随着3-BrPA、SCT浓度增高而上升（P＜0.05）。
　　6.细胞内HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC产量检测结果:用药24h、48h后，3-BrPA组HK活性较SCT组及空白对照组均显著降低(P＜0.05)，且呈药物浓度及作用时间依赖性，5-FU组中HK活性亦较SCT组和空白对照组低(P＜0.05)。SCT组HK活性与空白对照组相比未见明显的差异(P＞0.05)。SCT组PFK-1活性随药物浓度增加及作用时间延长而显著降低(P＜0.05)，3-BrPA组及5-FU组PFK-1活性与空白对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。PK活性在各实验组中均未见明显差异(P＞0.05)。3-BrPA组及SCT组ATP和LC产量较空白对照组均明显减少(P＜0.05)，表现为时间和药物浓度的依赖性。5-FU处理细胞8h后ATP产量减少，处理48h后乳酸也较空白对照组降低(P＜0.05)。
　　7.WB实验结果:Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3蛋白表达量随3-BrPA及SCT药物浓度的增加而明显增高，而Bcl-2、Survivin蛋白的表达则较空白组明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。5-FU组中Bcl-2、Survivin蛋白表达较空白对照组明显降低，而Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3则较之增高(P＜0.05)。
　　结论:3-BrPA、SCT在体外能显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901的增殖，导致细胞周期阻滞，抑制糖酵解关键么活性并通过ROS蓄积，激活线粒体凋亡通路，抑制Survivin蛋白表达而诱导肿瘤细胞凋亡。
　　第二部分、人胃癌细胞裸鼠胃原位移植瘤模型构建及Micro-PET/CT检测
　　方法:取6只雌性BALB/C裸鼠，于双侧前肢腋背部皮下注射200ul胃癌细胞悬液。待裸鼠皮下瘤长至直径约8-10mm时，取出皮下移植瘤，进行鼠间传代，共6代。取150只雌性BALB/C裸鼠，麻醉后通过医用OB生物胶黏贴法将肿瘤组织块种植于胃壁浆肌层下，建立裸鼠胃原位癌模型。术后2周，随机分成8组，每组18只，每日一次腹腔注射相应药物，观察裸鼠体重、饮食及活动度变化。连续用药4周后，每组随机选取6只裸鼠，利用18F-FDG作为放射性示踪剂，行Micro-PET/CT扫描，余裸鼠用于后续实验。
　　结果:
　　1.成功构建人胃癌细胞SGC-7901裸鼠胃原位移植瘤模型，成瘤率约95％。
　　2.腹腔注射实验浓度的3-BrPA及SCT后，裸鼠体重缓慢增长，未见明显饮食及活动度下降。
　　3.各组胃原位移植瘤病灶放射性示踪剂集聚值(％ID/g)分别为:3-BrPA-L组2.703±0.214、3-BrPA-M组2.047±0.286、3-BrPA-H组1.348±0.142、SCT-L组2.527±0.279、SCT-M组1.975±0.245、SCT-H组1.228±0.136、5-FU组2.187±0.276、PBS组3.285±0.389。3-BrPA组及SCT组中18F-FDG集聚随着药物浓度的升高而减少，与PBS组对比有明显差异(P＜0.05)。5-FU组中18F-FDG集聚也较PBS组降低，对比具有显著性差异（P＜0.05）。
　　结论:通过医用OB生物胶黏贴法可成功构建裸鼠胃原位移植瘤模型，腹腔注射3-BrPA及SCT可安全、有效地降低肿瘤细胞代谢，抑制肿瘤生长。
　　第三部分、3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对裸鼠胃原位移植瘤影响的体内研究
　　实验方法:构建裸鼠胃原位移植瘤模型，连续腹腔注射相应药物4周后，各组随机选取6只裸鼠，检测血常规及肝肾功能;测量移植瘤体积及重量;HE染色观察移植瘤组织病理形态，肝肾组织病理学改变;紫外比色法检测移植瘤HK、PFK-1、PK活性，分光光度法检测ATP及乳酸含量;TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡;透视电镜(TEM)观察移植瘤细胞超微结构;RT-qPCR检测相关凋亡基因mRNA表达;免疫组织化学法(IHC)检测相关凋亡蛋白表达;各组余裸鼠继续用药至死亡，统计生存时间。
　　结果:
　　1.裸鼠血常规及肝肾功能:3-BrPA组及SCT组裸鼠白细胞、血红蛋白、血小板、白蛋白、谷丙转氨酶、总胆红素、肌酐及尿素氮与PBS组比较，均无明显差异(P＞0.05);5-FU组裸鼠白细胞、血小板及白蛋白可见不同程度降低，而谷丙转氨酶、总胆红素、肌酐及尿素氮可见不同程度的升高，与PBS组对比均有显著性差异（P＜0.05）。但各组裸鼠的血红蛋白未见明显异常(P＞0.05)。
　　2.移植瘤生长及裸鼠生存时间、3-BrPA组、SCT组及5-FU组移植瘤体积及重量均较PBS组减小，差异有统计学意义(P＜0.05)，随着3-BrPA及SCT浓度增加，其瘤体积及瘤重抑制率均增强。3-BrPA组，SCT组及5-FU组裸鼠生存时间均较PBS组明显延长(P＜0.05)。
　　3.移植瘤HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC产量:3-BrPA组HK活性随药物剂量增加而降低，而SCT组及PBS组未见明显改变，对比有统计学意义(P＜0.05)，5-FU组HK活性也较SCT组和PBS组减低（P＜0.05）。SCT组PFK-1活性显著低于3-BrPA组、5-FU组及PBS组(P＜0.05)，呈剂量依赖性改变。各组PK活性未见明显差异(P＞0.05)。3-BrPA组、SCT组及5-FU组ATP和LC产量与PBS组对比，均可见明显降低(P＜0.05)，且3-BrPA组及SCT组中ATP和LC产量改变呈药物浓度依赖性。
　　4.移植瘤及肝肾组织HE染色:移植瘤组织HE染色可进一步证明模型成功建立。3-BrPA组及SCT组裸鼠肝肾组织切片中未见明显组织病理学改变，而5-FU组可见点状坏死、细胞空泡样改变或炎性细胞浸润等改变。
　　5.TUNEL染色及TEM结果:3-BrPA组及SCT组移植瘤平均凋亡指数(AI)呈剂量依赖性升高，与PBS组对比，差异有统计学意义（P＜0.05），5-FU组AI较PBS组亦可见明显增高（P＜0.05）。3-BrPA组、SCT组及5-FU组移植瘤细胞中可见典型的细胞凋亡超微结构改变:细胞皱缩或破裂，胞核碎裂、染色质边聚，胞质内空泡形成，内质网肿大，线粒体水肿呈空泡样变性，线粒体嵴模糊、消失，凋亡小体形成等。而PBS组移植瘤细胞胞核较大核仁明显，未见明显凋亡变化。
　　6.IHC结果:3-BrPA组及SCT组移植瘤中cleaved caspase-9、cleavedcaspase-3蛋白表达量随药物浓度升高而增多，与PBS组相比均可见明显差异(P＜0.05)。此外，cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白在5-FU组中表达量亦明显高于PBS组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　7.RT-qPCR检测结果:3-BrPA组及SCT组移植瘤中Bax、Cyt-C mRNA表达均呈剂量依赖性升高，而Bcl-2、Survivin的表达则呈剂量依赖性降低，与PBS对照组相比均具有显著差异(P＜0.05)。同时，在5-FU组移植瘤中Bax、Cyt-C也较PBS组表达增加，而Bcl-2、Survivin表达则明显减少(aP＜0.05)。
　　结论:腹腔内注射3-BrPA及SCT能安全有效的抑制裸鼠原位移植瘤的生长、延长荷瘤鼠生存时间，诱导原位移植瘤细胞凋亡。
　　全文结论:本研究分别通过内体外实验，研究3-BrPA及SCT对胃癌细胞SGC-7901的影响，并探索其抗肿瘤作用机制。
　　1.体外实验表明3-BrPA及SCT可通过阻滞细胞周期，抑制糖酵解关键酶HK及PFK-1的活性、抑制胃癌细胞糖酵解速率、减少ATP及乳酸产量，导致细胞能量枯竭。并首次发现3-BrPA及SCT可促进细胞内ROS蓄积，上调线粒体凋亡通路中Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，从而引起Cyt-C的释放，激活caspase-3，同时抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达来促进胃癌细胞出现凋亡。
　　2.通过建立裸鼠胃原位移植瘤模型，在国内外属首次通过腹腔内注射途径应用3-BrPA及SCT并结合18F-FDG Micro-PET/CT扫描来研究评估药物的抗肿瘤作用，结果证实腹腔内使用3-BrPA及SCT同样可以抑制糖酵解酶活性，降低胃原位移植瘤组织糖酵解反应水平，进而导致细胞能量耗竭、酸性微环境破坏，引起DNA持续降解，并上调促凋亡基因Bax、Cyt-C mRNA的表达、下调抑凋亡基因Bcl-2及Survivin mRNA的表达，活化caspase-9及caspase-3来共同发挥其抗肿瘤的作用。因此，3-BrPA及SCT确实能安全有效抑制胃癌细胞，值得进一步深入研究。

目录

声明

个人简历

论文说明

摘要

前言

参考文献

第一部分 3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对胃癌细胞影响的体外实验

材料、仪器与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

第二部分 人胃癌细胞裸鼠胃原位移植瘤模型构建及Micro-PET／CT检测

实验材料、仪器与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

第三部分 3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对裸鼠胃原位移植瘤影响的体内研究

材料、仪器与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

全文小结

本实验存在的不足与缺陷

附录

综述 胃癌实验动物模型研究进展概述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文