基于血浆代谢组学的毛鸡酒补血作用及其机制研究

摘要

背景和目的:毛鸡酒(MJ)是一种传统保健酒，在民间常用于补血，但其补血作用及机制尚未报道。本研究旨在探讨MJ对乙酰苯肼(APH)和环磷酰胺(CTX)联合所致血虚模型大鼠的补血作用，并基于代谢组学技术分析血虚模型大鼠血浆中代谢物的变化，以期阐明MJ的补血作用机制，为MJ的进一步研发和临床应用奠定基础。
　　方法:36只SPF级雌性SD大鼠随机分为6组:正常对照组，模型组，复方阿胶浆组(FEJ，剂量为6.0mL/kg)，毛鸡酒高、中、低剂量组(MJ-H、MJ-M、MJ-L，剂量分别为10.0mL/kg、5.0mL/kg、2.5mL/kg)，每组6只。除正常对照组外，其余各组大鼠均皮下注射APH和腹腔注射CTX复制血虚大鼠模型。给药10d后，采血，处死大鼠，解剖收集肝脏、胸腺、脾脏和肺。分别采用全自动血细胞分析仪检测大鼠外周血样品中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)和血小板(PLT);比重法计算肝脏指数、胸腺指数、脾脏指数和肺指数;试剂盒法测定肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量;HE染色法观察脾脏组织病理学变化;免疫组化法检测脾脏组织中Bcl-2和Bax蛋白表达。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q/TOF-MS）检测正常对照组、模型组、MJ-H、MJ-M和MJ-L组大鼠血浆中的代谢物，应用主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)和t检验筛选血浆中差异代谢物，寻找潜在的生物标志物，结合生物标志物涉及的代谢通路，阐明MJ的补血作用机制。
　　结果:(1)MJ对血虚模型大鼠外周血指标的影响:与正常对照组比较，模型组的外周血WBC、RBC、HGB、HCT和PLT均显著降低(P＜0.01);与模型组比较，FEJ、MJ-H和MJ-M的WBC、RBC、HGB和HCT均显著升高(P＜0.05)，MJ-L的WBC、RBC、HGB和HCT均有一定程度升高，但仅RBC的升高具有统计学差异(P＜0.05)。MJ各剂量组的PLT与模型组的差异无统计学意义。(2)MJ对血虚模型大鼠脏器指数的影响:与正常对照组比较，-模型组的肝脏指数和脾脏指数均显著升高(P＜0.01)，胸腺指数显著降低(P＜0.01);与模型组比较，FEJ和MJ各剂量组的肝脏指数和脾脏指数有降低趋势，胸腺指数有升高趋势。正常对照组、FEJ和MJ各剂量组的肺指数与模型组的差异无统计学意义。(3)MJ对血虚模型大鼠肝脏组织中SOD、T-AOC和MDA的影响:与正常对照组比较，模型组的T-AOC显著降低(P＜0.01)，MDA含量显著升高(P＜0.01);与模型组比较，FEJ、MJ-H、MJ-M和MLL的T-AOC显著升高(P＜0.05)，FEJ、MJ-H和MJ-M的MDA显著降低(P＜0.05)。正常对照组、FEJ和MJ各剂量组的SOD活力与模型组的差异无统计学意义。(4)MJ对血虚模型大鼠脾脏组织中Bcl-2和BaX蛋白表达的影响:与正常对照组比较，模型组大鼠脾脏组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达和Bcl-2/Bax比值均显著降低(P＜0.05);与模型组比较，FEJ、MJ-H和MJ-M大鼠脾脏组织中Bcl-2蛋白的表达和Bcl-2/Bax比值均显著升高（P＜0.05），FEJ和MJ-H大鼠脾脏组织中的Bax蛋白表达显著升高(P＜0.05)。(5)血虚模型大鼠血浆的代谢组学分析:在PCA得分图和OPLS-DA得分图中正常对照组和模型组大鼠血浆的样本点均完全分离，说明造模后大鼠血浆中代谢物发生了变化，从代谢物的变化说明血虚大鼠模型复制成功。根据代谢物在OPLS-DA的变量投影重要度(VIP)和t检验从大鼠血浆中筛选出15种潜在生物标志物。模型组与正常对照组相比，血浆中尿嘧啶、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸、胞嘧啶核苷、L-谷氨酸、L-精氨酸、乳清酸、尿苷、胆红素、原卟啉和亚油酸的相对强度显著升高(P＜0.05)，氧化谷胱甘肽、吡啶甲酸、L-色氨酸、5-羟基吲哚乙酸和邻甲酰氨基苯甲酸的相对强度显著降低(P＜0.05);MJ治疗组与模型组相比，血浆中尿嘧啶、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸、胞嘧啶核苷、L-谷氨酸、L-精氨酸、乳清酸、尿苷、胆红素、原卟啉和亚油酸的相对强度均有不同程度降低，氧化谷胱甘肽、吡啶甲酸、L-色氨酸、5-羟基吲哚乙酸和邻甲酰氨基苯甲酸的相对强度具有不同程度升高，有趋于正常对照组趋势。通过代谢通路分析，结果显示以上潜在生物标志物与亚油酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、卟啉和叶绿素代谢和嘧啶代谢等代谢通路相关。
　　结论:MJ对APH和CTX联合导致的血虚模型大鼠有一定的治疗作用，表现为外周血常规的改善，肝脏指数、胸腺指数和脾脏指数的回调，脾脏抗氧化能力的增强损伤和实质损伤的减轻。通过代谢组学方法证明MJ的补血作用与调节亚油酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，色氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，卟啉和叶绿素代谢，嘧啶代谢等代谢通路的异常相关，说明将代谢组学在中药复方疗效和机制的研究中是一种有很有前途的技术。

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摘要

前言

第一章 毛鸡酒对乙酰苯肼和环磷酰胺联合所致血虚模型大鼠的影响

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

本章小结

第二章 毛鸡酒对乙酰苯肼和环磷酰胺联合所致血虚模型大鼠血浆代谢组学的研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

本章小结

全文结论

本研究的创新点

参考文献

综述 代谢组学在血虚证动物模型中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文