微小核糖核酸208a在心房颤动心房缝隙连接蛋白40重构中的作用研究

摘要

目的:心房颤动（房颤）是临床上最常见的心律失常，是全球主要的公共健康负担之一。而房颤的发病机制复杂，目前认为心房电重构是房颤发生的中心环节。心房电重构导致心房有效不应期和动作电位时程缩短，不应期的生理性频率适应性减小或缺失，电传导减慢，传导的异质性增加;心房不应期的缩短不成比例地较传导速度减缓，折返子波的波长缩短，促进折返活动。心脏中各种缝隙连接蛋白(Connexin，Cx)的密度或（和）空间分布的变化会引起心房冲动扩布的变化。因此，探索心房中Cx的密度或（和）空间分布的变化机制，逆转心房电重构，将为房颤的治疗提供新的思路。缝隙连接蛋白40(Cx40)主要在心房和心室传导系统表达，是心脏传导系统重要的调节因子，其在心肌细胞连接处的密度和空间分布变化在心脏电传导异常中起着重要作用。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一类具有高度保守序列的内源性非编码小RNA，其通过与靶基因mRNA3'端非翻译区(3'-untranslated region，3'UTR)完全或不完全互补结合，在转录后水平抑制翻译，从而负向调控靶基因或靶蛋白。研究表明miRNA-208a特异表达于心脏，在心肌梗死、扩张性心肌病、心律失常等心血管疾病发病机制中起重要作用。生物信息学预测编码Cx40的GJA5是miRNA-208a-3p调控的靶基因，而miRNA-208a-3p是否调控Cx40参与房颤心房电重构仍未知。本研究通过检测窦律患者和房颤患者右心耳miRNA-208a-3p、Cx40表达;构建miRNA-208a-3p过表达、低表达人心肌细胞(AC16细胞)模型，检测细胞Cx40表达，采用双荧光素酶报告基因检测系统进行miRNA-208a-3p靶基因验证，探索miRNA-208a-3p在房颤心房Cx40重构中的作用。
　　方法:本研究采用原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry,ISHH）、实时定量聚合酶链式反应(Real time quantity polymerase chain reaction，RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)、免疫组织化学(Immune histochemical，IHC)检测在广西医科大学第一附属医院心脏外科行瓣膜置换术或修补术的风湿性心脏病长期持续性房颤和窦性心律（窦律）患者右心耳hsa-miRNA-208a-3p、Cx40mRNA和蛋白表达。在体外细胞学实验中，采用miRNA-208a-3p mimic和inhibitor瞬时转染人心肌细胞（AC16细胞系）构建过表达和低表达miRNA-208a-3p AC16细胞模型，检测AC16细胞Cx40mRNA和蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因检测系统进行miRNA-208a-3p靶基因验证。
　　结果:(1)对房颤组(n=19)和窦律组（n=18）患者的临床数据进行统计分析，房颤组患者左心房内径（65.16±9.81）大于窦律组（46.06±7.57）(p＜0.05)，两组间年龄、性别、心脏射血分数、心功能比较均无统计学差异(p＞0.05)。房颤组患者右心耳miRNA-208a-3p表达20.510(70.167)高于窦律组1.169(5.991)(p＜0.05-)。窦律组患者右心耳CX40mRNA表达0.354(0.527)与房颤组0.372(0.303)比较无统计学差异(p＞0.05);窦律组患者右心耳Cx40蛋白表达（0.394±0.168）高于房颤组（0.300±0.104）(p＜0.05)。Cx40主要表达于窦律患者右心耳心肌细胞端-端连接处，而在房颤组患者，Cx40在侧-侧连接处分布多于窦律组。两组患者右心耳miRNA-208a-3p与Cx40表达呈负相关(r=-0.345，p＜0.05)。(2)过表达miRNA-208a-3p的AC16细胞Cx40mRNA（0.455±0.110）与阴性对照组（0.587±0.127）和空白对照组0.547(0.291)比较无统计学差异(p＞0.05);过表达miRNA-208a-3p的AC16细胞Cx40蛋白（0.061±0.020）低于阴性对照组0.175(0.060)和空白对照组（0.211±0.023）(p＜0.05)。低表达miRNA-208a-3p的AC16细胞Cx40mRNA（3.889±3.718）与阴性对照组（4.720±3.761）和空白对照组（2.427±2.272）比较无统计学差异(p＞0.05);低表达miRNA-208a-3p的AC16细胞Cx40蛋白(0.243±0.079)高于阴性对照组（0.078±0.033）和空白对照组（0.071±0.050）(p＜0.05)。转染重组pmirGLO-载体质粒pmirGlo-hGJA53'-UTR的miRNA-208a-3p mimic组荧光素酶活性（30.084±0.790）与miRNA mimic NC组荧光素酶活性（25.163±1.030）比较无统计学差异(p＞0.05)，转染重组pmirGLO-载体质粒pmirGlo-mut-hGJA53'-UTR的miRNA-208a-3p mimic组荧光素酶活性（27.996±3.130）与miRNAmimic NC组荧光素酶活性（24.014±0.468）比较无统计学差异(p＞0.05)。
　　结论:miRNA-208a是Cx40上游的负性调控因子，在慢性房颤患者右心耳，miRNA-208a上调促进Cx40重构。miRNA-208a通过调控Cx40重构在心房电重构过程发挥作用，有望成为治疗房颤的潜在靶点。

目录

声明

个人简历

中英文缩略词对照表

摘要

前言

第一部分 miRNA-208a与心房Cx40重构的相关性研究

材料与方法

1．研究对象

2．主要仪器

3．主要试剂

4．实验方法

5．统计方法

结果

1．窦性心律组与心房颤动组患者一般临床资料

2．窦性心律组与心房颤动组患者右心耳miRNA-208a-3p表达

3．窦性心律组与心房颤动组患者右心耳Cx40表达

4．miRNA-208a-3p与Cx40蛋白的相关性分析

讨论

第二部分 miRNA-208a-3p参与心房颤动Cx40重构的机制研究

材料与方法

1．研究对象

2．主要仪器

3．主要试剂

4．实验方法

5．统计方法

结果

1．瞬时转染后AC16细胞Cx40表达

2．miRNA-208a对Cx40调控的验证

讨论

参考文献

研究结论

创新点

研究局限性

综述 微小核糖核酸208家族与心血管疾病的研究进展

致谢

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