血小板反应蛋白-1在妊娠高血糖孕鼠子代心肌组织中的表达及其与细胞凋亡的关系研究

摘要

目的：
　　检测乳鼠心肌血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）和心肌细胞凋亡相关因子的表达，探讨TSP-1在妊娠高血糖孕鼠子代心肌组织中的表达及其与心肌细胞凋亡的关系，阐述妊娠高血糖孕鼠引起子代心肌损伤的机制，为妊娠期糖尿病所致后代先天性心脏缺陷的防治提供科学依据。
　　方法：
　　将30只成功受孕的SD雌鼠按1∶5的比例分为正常组和妊娠高血糖组，妊娠高血糖组一次性按40mg/kg予以腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，正常组一次性予等量0.1mmol/L(PH4.5)柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液腹腔注射作为对照。孕鼠自然分娩后采集乳鼠心脏组织，制作石蜡切片，HE染色后于光学显微镜下观察乳鼠心肌组织形态学的改变;运用免疫组织化学法检测乳鼠心肌组织TSP-1的表达;实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcript-polymerase chain reaction,qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot，WB)测定乳鼠心肌TSP-1和凋亡相关基因及蛋白的表达，原位末端凋亡标记法(transferase-mediated uridine nick end labeling,TUNEL)检测乳鼠心肌细胞凋亡率。
　　结果：
　　1.STZ构建妊娠糖尿病模型成功率为88.89％。STZ干预后妊娠高血糖组母鼠血糖相对正常组明显升高(P＜0.001)，孕鼠多饮、多尿和多食症状明显，毛色枯黄，精神萎靡，孕期体重增加少于正常组(P＜0.001)。
　　2.妊娠高血糖组乳鼠心肌损伤明显，细胞排列疏松紊乱、坏死炎性细胞浸润、细胞水肿，可见细胞结构不清、断裂。
　　3.免疫组化结果显示妊娠高血糖组乳鼠心肌TSP-1多分布于血管周围、心肌细胞排列疏松紊乱区域和坏死炎性细胞浸润区域，TSP-1平均吸光度相对正常组明显增加(P＜0.01)。qRT-PCR和WB结果显示妊娠高血糖组乳鼠心肌TSP-1mRNA及蛋白的表达量均比正常组增加(P＜0.01)。
　　4.TUNEL检测发现妊娠高血糖组乳鼠心肌细胞凋亡率明显高于正常组(P＜0.01)。与正常组相比，妊娠高血糖组乳鼠心肌caspase-3mRNA，cleavedcaspase-3和Bax蛋白的表达水平显著增高(P＜0.05），而caspase-3和Bcl-2蛋白的表达水平显著下降(P＜0.05);同时，妊娠高血糖组乳鼠心肌Bax蛋白/Bcl-2蛋白的比例升高(P＜0.001)。
　　5.双变量相关分析结果显示，妊娠高血糖组乳鼠心肌组织TSP-1mRNA与caspase-3mRNA的表达水平呈正相关关系（r=0.680，P＜0.01）。TSP-1蛋白与cleaved caspase-3蛋白（r=0.841，P＜0.001）、Bax蛋白(r=0.791，P＜0.001)的表达水平均呈正相关关系;TSP-1蛋白与caspase-3蛋白（r=-0.804，P＜0.001）、Bcl-2蛋白（r=-0.767，P＜0.001）的表达水平均呈负相关关系。
　　结论：
　　1.孕鼠妊娠高血糖状态可导致子代心肌损伤和TSP-1表达增多。
　　2.妊娠高血糖孕鼠子代心肌细胞凋亡明显增加，caspase-3和Bcl-2蛋白的表达水平下降，cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平升高。
　　3.妊娠高血糖孕鼠子代心肌TSP-1与细胞凋亡因子的表达呈相关性，提示TSP-1可能通过参与高血糖孕鼠子代心肌细胞的凋亡过程影响心脏的发育。

目录

个人简历

论文缩写词汇中英对照表

摘要

前言

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要实验试剂

1．3 主要实验仪器

1．4 实验方法

1．4．1 孕鼠高血糖模型建立

1．4．2 标本采集及处理

1．4．3 乳鼠心脏组织切片及苏木精-伊红(HE)染色

1．4．4 TUNEL法检测乳鼠心肌细胞凋亡情况

1．4．5 免疫组织化学法观察乳鼠心肌TSP-1表达情况

1．4．6 Western blot定量检测乳鼠心肌组织TSP-1和相关凋亡蛋白表达情况蛋白提取

1．4．7 实时荧光定量PCR测定TSP-1 mRNA和caspase-3 mRNA含量

1．4．8 统计学处理

2 实验结果

2．1 妊娠期高血糖模型建造结果

2．2 STZ干预前后妊娠高血糖组与正常组孕鼠孕期体重变化情况比较

2．3 STZ干预前后妊娠高血糖组与正常组孕鼠血糖值变化情况比较

2．4 光镜观察乳鼠心肌组织病理变化

2．5 妊娠高血糖组与正常组乳鼠心肌细胞凋亡情况比较

2．6 免疫组化检测乳鼠心肌TSP-1蛋白表达结果

2．7 Western blot检测乳鼠心肌TSP-1蛋白表达结果

2．8 乳鼠心肌凋亡蛋白caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表达结果

2．9 RT-PCR检测乳鼠心肌TSP-1和caspase-3 mRNA的表达结果

2．10 孕鼠子代心肌TSP-1的表达与细胞凋亡相关因子表达量之间的相关性分析

3 讨论

3．1 STZ制备妊娠期高血糖模型

3．2 高血糖孕鼠子代心肌TSP-1表达水平的改变

3．3 GDM对子代心脏的影响

4 结论

参考文献

综述 血小板反应蛋白-1及血小板反应蛋白-1与心血管疾病的关系

致谢

攻读学位期间发表及待发表的文章