微小RNA-647在胃癌中的作用及相关机制研究

摘要

背景与目的：胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，胃癌位居肿瘤死亡的第二位。中国是胃癌高发国家，全世界每年新发生的胃癌为75.5万例，约35％发生在中国;胃癌的早期症状不明显，确诊胃癌时约有40％的患者已经伴有远处转移。目前临床上主要运用放疗，化疗，手术等手段治疗胃癌，但其总体死亡率并没有得到明显下降，进展期胃癌肿瘤组织的快速生长和远处转移是引起胃癌高死亡率的主要原因。与传统治疗相比，基因治疗具有靶向精准，特异性强，副作用小等优点，2004年1月我国研发的用于头颈部治疗肿瘤治疗的重组p53腺病毒注射液，在全球率先上市。尽管大量的研究已经报道了胃癌发生发展的机制，但是其发病的病理生理学改变仍不明确。因此，进一步探索胃癌发生发展的靶向治疗因子是早期诊断和治疗胃癌以及降低其死亡率的重要突破口。
　　近年研究发现，微小RNA(miRNA、microRNA)作为内源性非编码RNA具有靶向抑制其下游基因表达的生物学特性，与细胞增殖、转移、凋亡等生物进程相关，调控包括肿瘤在内的多种人类疾病，有望成为肿瘤治疗的靶向基因。由于microRNA可靶向调控数百个基因的表达，其在恶性肿瘤的诊断和治疗方面显示出了非常好的应用前景。近年研究发现，miRNAs参与调节包括胃癌在内的多种肿瘤的生长和转移，同时Rawlings-Goss等发现miR-647与多种肿瘤相关并能作为胃癌发生发展的生物学标记物，但作用机制尚不明确。为进一步探讨miR-647在胃癌发生发展的作用，本研究首先拟通过荧光定量PCR方法检测人胃癌组织、人胃癌细胞株中miR-647表达情况，并分析其表达与临床病理特征（年龄、性别、肿瘤大小、转移和病理分型等）的相关性，以期明确miR-647表达在胃癌诊断和预后中的意义。进一步构建miR-647过表达慢病毒载体，通过体内实验与体外实验观察miR-647对胃癌细胞的作用，运用基因芯片、生物学预测软件、荧光定量PCR和Western Blot蛋白印记实验探讨其作用机制，以期明确miR-647在胃癌发生发展中的作用与机制。
　　方法：
　　1.提取胃癌组织与胃癌细胞的总RNA（Trizol法），应用荧光定量PCR比较胃癌组织与正常癌旁组织，胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞中miR-647的表达情况，进一步分析miR-647表达与胃癌患者临床病理特征（年龄、性别、肿瘤大小、转移和病理分型等）的相关性;Transwell检测人胃癌细胞株HGC-27、AGS、SGC-7901、MGC-803的侵袭能力。
　　2.构建miR-647过表达的慢病毒载体，阳性重组克隆进行序列验证;采用miR-647过表达的慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803，其中空白组（Ctrl组）不做任何处理常规培养细胞，阴性组(NC组)转染空病毒载体，实验组（647组）转染miR-647过表达的慢病毒载体，嘌呤霉素筛选成功转染的细胞株，荧光定量PCR检测转染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中miR-647的表达;CCK-8法检测miR-647过表达对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞检测miR-647过表达对胃癌细胞周期和凋亡的影响;电镜下观察miR-647对胃癌细胞的微观形态改变;将成功转染miR-647过表达慢病毒颗粒的人胃癌细胞株细胞悬液100ul（2×107个/ml）接种于5～6周裸鼠腋下（8只/组），每三天测量瘤体长短径一次并计算肿瘤大小，21天后脱颈法处死裸鼠，HE法确认肿瘤组织。
　　3.划痕实验与Transwell实验分别检测miR-647对人胃癌细胞迁徙能力和侵袭能力的影响;将成功转染miR-647过表达慢病毒颗粒的人胃癌细胞株细胞悬液100ul（8×105个/ml）注射入5～6周龄裸鼠尾静脉（10只/组），36天后脱颈法处死裸鼠，HE染色检测胃痛转移模型的肝肺转移情况。
　　4.采用人类全基因组表达芯片谱检测miR-647过表达后人胃癌MGC-803的差异表达基因;生物信息学软件预测miR-647的靶基因;荧光定量PCR和Western Blot蛋白印迹实验检测miR-647预测靶基因ANK2以及其下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的mRNA与蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1.荧光定量PCR结果显示，与对应癌旁正常组织相比，在70例胃癌患者中43例患者胃癌组织中miR-647表达量下降，占61.43％;在70例胃癌病人中，与对应癌旁正常组织相比，miR-647表达量明显下调(P＜0.05);与胃黏膜正常细胞株GES-1相比，miR-647在人胃癌细胞株HGC-27，AGS，SGC-7901和MGC-803中表达下调(P＜0.05)，Transwell结果显示，与胃癌细胞株HGC-27和AGS相比，SGC-7901和MGC-803具有更强的侵袭能力且miR-647表达量与侵袭能力呈负相关（P＜0.05)。临床病理资料分析结果表明miR-647的表达量与胃癌组织的肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关(P＜0.05)。
　　2.阳性重组克隆测序结果显示miR-647过表达载体序列正确;荧光定量PCR显示，miR-647过表达慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803后miR-647表达量上调(P＜0.05);CCK-8法提示，与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的细胞增殖能力降低（P＜0.05）;流式细胞仪检测显示与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的细胞周期阻滞在G0/G1期(P＜0.05)，凋亡率增加(P＜0.05);透射电镜提示在647组SGC-7901和MGC-803中能观察到细胞凋亡的典型特征;裸鼠瘤体内实验显示，与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的裸鼠皮下移植瘤模型生长较慢(P＜0.05); HE染色显示皮下移植瘤体为恶性肿瘤组织。
　　3.划痕实验结果显示，与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803细胞迁移能力下降(P＜0.05); Transwell实验结果显示，与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803细胞侵袭能力下降(P＜0.05);转移瘤模型结果显示，与NC组(50％)与Ctrl组(70％)相比，miR-647过表达的647组SGC-7901细胞肝转移率为10％，转移率明显降低（P＜0.05）。
　　4.全基因组检测31741个基因，803-647与803-NC组相比，一共223个基因差异性表达（筛选条件为log2| Flod change｜≧1.5，P＜0.05），其中上调基因数为113个，下调基因数为110个;miRanda，TargetScan和microRNA三个生物学预测软件显示，至少两个预测软件预测的miR-647的靶基因交集有382个;芯片表达差异下调基因和生物信息学软件预测靶基因的交集为ANK2、ZNF609、KNDC1和TRIM4;荧光定量PCR显示，ANK2与KNDC1在SGC-7901和MGC-803两株细胞中均下调（P＜0.05）;由于只有ANK2与肿瘤发生相关，我们拟定ANK2为miR-647的下游靶基因的研究对象;同时Western Blot结果表明miR-647在SGC-7901和MGC-803两株细胞细胞中抑制ANK2蛋白表达(P＜0.05);荧光定量PCR和Western Blot蛋白印迹实验结果显示，与NC组与Ctrl组相比，miR-647过表达的647组中miR-647下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的mRNA与蛋白表达均下调（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.miR-647在胃癌组织中的表达低于癌旁正常组织，且与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关;miR-647在胃癌细胞株中的表达低于胃黏膜正常上皮细胞株且其表达量与细胞的侵袭能力呈负相关。
　　2.成功构建miR-647过表达慢病毒载体与miR-647过表达人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803;miR-647过表达在体外能抑制人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的增殖，使细胞发生G0/G1期阻滞，凋亡增加;同时，在体内能抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长。
　　3.miR-647过表达能在体内外抑制人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的转移能力。
　　4.ANK2可能为miR-647的直接靶基因，miR-647过表达可使人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的ANK2和FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的mRNA与蛋白表达降低。
　　创新点：
　　1.微小RNA与细胞增殖、转移、凋亡等生物进程密切相关，调控包括肿瘤在内的多种人类疾病，本研究通过检测miR-647在胃癌组织中的表达，并进一步分析其与临床病理特征的关系，初步阐明了miR-647在胃癌发生发展中的作用。
　　2.本研究应用分子生物学技术构建目的miR-647的慢病毒载体，从增殖和转移两个方面观察其对胃癌细胞生物学行为的影响，并进一步探讨miR-647在胃癌发生和发展中的作用机制，以期为胃癌的早期诊断和治疗提供新的方向。

目录

声明

个人简历

论文说明

摘要

前言

参考文献

技术路线图

第一章 miR-647在人胃癌组织与胃癌细胞株中的表达情况

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第二章 miR-647对人胃癌细胞增殖的影响

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第三章 miR-647对人胃癌细胞侵袭转移的影响

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第四章 miR-647对人胃癌细胞作用机制的研究

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

全文总结

本课题存在的缺陷和不足

附录

综述 miRNA在胃癌诊断治疗与耐药中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表论文