基于细胞自噬探讨龙蛭汤含药血清促进人脐静脉内皮细胞管腔形成的机理

摘要

目的:通过H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤，构建细胞自噬模型，研究龙蛭汤含药血清对受损HUVECs的保护作用及对细胞管腔形成的影响，进一步探讨龙蛭汤含药血清促HUVECs管腔形成的可能机制。
　　方法:依据中药血清药理学和药物代谢动力学方法制备SD大鼠中药含物血清。将人脐静脉内皮细胞株进行培养、传代，取处于生长对数期的HUVECs与含药血清及有关药物共孵。(1)采用CCK-8法检测不同浓度（梯度浓度分别为50umol/L、100umol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L和1600umol/L)H2O2处理4h对HUVECs增殖的抑制作用，CCK-8法检测400umol/L H2O2在不同作用时间下(2h、4h、8h、12h、16h)对HUVECs增殖的影响，选择H2O2最佳作用浓度及合适作用时间。分组设置正常组、空白血清组、H2O2组、龙蛭汤含药血清+H2O2组、补阳还五汤含药血清+H2O2组等五组。通过光学显微镜观察细胞形态学变化;划痕试验检测HUVECs迁移情况;人工基底膜(Matrigel)检测细胞的管腔形成能力。(2)依据实验(1)获得的H2O2最适作用浓度及合适作用时间，再设置正常组、空白血清组、H2O2组、龙蛭汤含药血清+H2O2组。通过体外建立H2O2诱导HUVECs自噬模型，通过HE染色法观察细胞形态学变化以及划痕和基质胶检测细胞迁移和管腔结构。采用透射电镜检测龙蛭汤对H2O2诱导HUVECs超微结构、自噬体的影响;免疫荧光法观察自噬蛋白LC3荧光表达的情况;western blot检测各组HUVECs自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达。阐释龙蛭汤促H2O2诱导HUVECs管腔形成的可能作用机制。
　　结果:(1)与正常组、空白血清组比较，H2O2组细胞形态则发生较大改变，呈不规则，并伴有细胞老化现象，HUVECs的细胞活性受到显著抑制(P＜0.01)。与H2O2组比较，补阳还五汤组HUVECs增殖能力上升(P＜0.01)，迁移距离更远，覆盖空白区域广(P＜0.01)，血管管腔形成数量增多(P＜0.01)。较补阳还五汤组，龙蛭汤组细胞具有较高增殖能力、更快迁移速度及迁移距离，可形成较多的管形腔及小分支，差异性显著(P＜0.05)。此外，24h后龙蛭汤组细胞仍能保持完整的管腔结构和形态，而补阳还五汤组则不能。(2)与正常组、空白血清组比较，H2O2组细胞迁移距离明显偏低，管腔结构数量较少(P＜0.01)。较H2O2组，龙蛭汤可降低H2O2引起的细胞损害，维持细胞形态，增强HUVECs的迁移能力和管腔形成能力，差异性明显(P＜0.05)。在透射电镜下，正常组和空白血清组可见HUVECs内有较丰富的线粒体、内质网等细胞器;H2O2组可见少许的自噬体，细胞质内空泡结构有所增加;而龙蛭汤组细胞胞质内双层膜样结构数量明显增多，弯曲延展形态并包裹着部分细胞器。从自噬相关蛋白表达情况看，较正常组和空白血清组，H2O2组LC3-Ⅱ、Becl in-1蛋白表达量均有所增加(P＜0.05);与H2O2组比较，龙蛭汤组LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达则明显升高(P＜0.01)。
　　结论:(1)龙蛭汤较补阳还五汤促HUVECs血管管腔形成和维持管腔结构上具有更优效果，表现在起效快，时效长等方面。(2)龙蛭汤对H2O2诱导HUVECs的自噬水平有上调作用，这可能是龙蛭汤促血管管腔形成的作用机制之一。

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摘要

前言

第一部分 龙蛭汤含药血清对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞形态、增殖、迁移及管腔形成的影响

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 龙蛭汤含药血清对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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