红芝发酵产漆酶及其在染料脱色中的应用研究

摘要

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化还原酶,能够催化多种化合物的氧化反应,具有广泛的作用底物,包括:酚类、芳胺类、羧酸类、生物色素、金属有机化合物和非酚类等物质。在食品工业、造纸工业、环境保护、生物检测、有机合成和能源开发等领域具有广阔的应用前景。本文是在实验室前期研究的基础上,对筛选获得的一株组成型漆酶高产菌株红芝的液态发酵条件、固态发酵条件、漆酶的酶学性质及漆酶粗酶液在染料脱色中的应用进行了较为全面的研究,研究结果如下:(1)红芝产漆酶液态发酵条件研究通过单因素实验及正交设计,对红芝液态发酵产漆酶的工艺参数进行优化。结果表明,红芝液态摇瓶培养产漆酶的适宜培养基组成为:蔗糖35 g/L、麦麸8g/L、硫酸铵6g/L、干酪素8g/L、CuSO4·5H2O0.02g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L、VB110mg/L、VC500mg/L;适宜的培养条件为:培养基初始pH值5.0,250mL三角瓶的装液量80mL,接种量3.75％(V:V),32℃,120r/min恒温振荡培养72h,漆酶活力达到最高2126U/mL(底物:愈创木酚)。同时对液态发酵产酶进程的研究发现,随着培养时间延长,培养基的pH值逐渐降低,达到最高酶活时培养基的pH值从5.0降为4.0,随后pH值保持稳定。(2)红芝产漆酶固态发酵条件研究对红芝固态发酵产漆酶的培养基和培养条件进行研究,结果表明:适宜固态发酵培养基为:以1.5:1甘蔗渣和麦麸为基质,葡萄糖0.5%、硫酸铵5%、CuSO4·5H2O0.01%、培养基含水率73%。适宜固态培养条件为:初始pH值4.0,接种量20%(V:W),28℃静置培养8d,酶活达到最高23803U/g。按上述的工艺条件,在聚丙烯塑料袋中进行放大培养,达到最高酶活的时间仍然是8d,而漆酶活力只有16087U/g。(3)红芝组成型漆酶酶学性质研究对红芝组成型漆酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该漆酶的最适作用温度为60℃,最适pH值为3.0,在50℃以下和pH2.5-4.0范围内较稳定,Cu2+、Mn2+对酶活有较强的促进作用,Cr3+、Hg2+、Fe2+对酶活有较强的抑制作用,其中Fe2+可使该漆酶完全失活;EDTA、DMSO、SDS对漆酶活力的抑制作用较大,使酶活力几乎下降一半;以愈创木酚作为底物,在最适温度和最适pH值条件下测得漆酶的表观Km值为0.13mmol/L,最大反应速率Vmax为234nmol/(mL·min)。(4)红芝漆酶对染料脱色的应用研究通过红芝固态发酵所产生的漆酶粗酶液,对蒽醌染料活性艳蓝KN-R,偶氮染料甲基橙和三芳甲烷染料结晶紫进行脱色实验,结果表明:蒽醌染料活性艳蓝KN-R可直接被该漆酶脱色,但脱色速率较低,反应3h达到平衡,添加小分子介质(ABTS)可明显提高脱色速率,反应60min即可达到平衡。偶氮染料甲基橙和三芳甲烷染料结晶紫不能直接被漆酶脱色,必须在反应体系中添加小分子介质。活性艳蓝KN-R适宜脱色条件为:活性艳蓝KN-R400mg/L, ABTS浓度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH4.0,在30℃条件下作用60min,脱色率达91%。甲基橙适宜脱色条件为:甲基橙50mg/L,ABTS浓度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH3.5,在30℃条件下作用90min,脱色率为78%。结晶紫适宜脱色条件为:结晶紫50mg/L,ABTS浓度10μmol/L,漆酶酶活30U/mL,pH3.0,在30℃条件下作用180min,脱色率为85%。通过研究金属离子对脱色率的影响发现,Cu2+、Mn2+、Mg2+促进漆酶对染料的脱色,提高脱色率,而Zn2+、Fe2+对脱色效果具有抑制作用。对处理前后的染料进行光谱扫描,处理后的染料特征吸收峰明显降低,而且在可见光范围内没有新的波峰出现。通过Linewear-Burk作图,发现以活性艳蓝KN-R、甲基橙和结晶紫为底物时,漆酶脱色反应速率与底物浓度关系符合米氏规律,Km值分别为3556mg/L、100mg/L、132mg/L,Vmax分别为91.7mg/L·min、2.4mg/L·min、1.67mg/L·min。

目录

中文摘要

Abstract

第1章 文献综述

1.1 漆酶的概念、来源和分布

1.2 真菌漆酶的结构特征和催化反应机理

1.2.1 真菌漆酶的分子特征

1.2.2 漆酶的铜中心

1.2.3 漆酶催化氧化

1.2.4 漆酶的催化机理

1.2.5 漆酶介质系统

1.3 漆酶活力的测定方法

1.3.1 酶活测定方法

1.3.2 酶活单位定义

1.4 漆酶的应用

1.4.1 食品工业

1.4.2 食用菌生产

1.4.3 造纸工业

1.4.4 环境保护

1.4.5 生物检测

1.4.6 其他方面

1.5 真菌漆酶研究进展

1.5.1 真菌漆酶的产生菌种

1.5.2 真菌漆酶合成的影响条件

1.6 立题背景及本文主要研究内容

参考文献

第2章 红芝产漆酶的液态发酵条件研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种

2.2.2 培养基

2.2.3 培养方法

2.2.4 漆酶活力测定

2.3 结果与分析

2.3.1 红芝菌在基础产酶培养基上的产酶时间

2.3.2 培养基碳、氮源组合正交实验及实验结果

2.3.3 碳、氮源浓度影响产酶的单因素实验

2.3.4 碳、氮源浓度组合对产酶的影响

2.3.5 无机金属离子对产酶的影响

2.3.6 装液量对产酶的影响

2.3.7 温度对产酶的影响

2.3.8 初始pH 值对产酶的影响

2.3.9 V_(Bl) 对产酶的影响

2.3.10 V_C 对产酶的影响

2.3.11 接种量对产酶的影响

2.3.12 液体发酵产酶历程

2.4 小结

参考文献

第3章 红芝产漆酶的固态发酵条件研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 原料

3.2.3 培养基

3.2.4 培养方法

3.2.5 放大培养

3.2.6 分析测定方法

3.3 结果与分析

3.3.1 不同纤维原料的比较

3.3.2 甘蔗渣和麦麸的比例对产酶的影响

3.3.3 葡萄糖用量对产酶的影响

3.3.4 硫酸铵用量对产酶的影响

3.3.5 培养基含水量对产酶的影响

3.3.6 培养基初始pH 值对产酶的影响

3.3.7 培养温度对产酶的影响

3.3.8 Cu~(2+)对产酶的影响

3.3.9 接种量对产酶的影响

3.3.10 聚丙烯塑料袋中放大培养

3.4 小结

参考文献

第4章 红芝组成型漆酶酶学性质研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 漆酶

4.2.2 漆酶制备

4.2.3 酶活测定

4.2.4 最适反应温度

4.2.5 热稳定性

4.2.6 最适反应pH 值

4.2.7 pH 稳定性

4.2.8 金属离子对酶活的影响

4.2.9 抑制剂对酶活的影响

4.2.10 动力学参数测定

4.3 结果与分析

4.3.1 温度对酶活的影响

4.3.2 漆酶的热稳定性

4.3.3 pH 值对酶活力的影响

4.3.4 漆酶的pH 稳定性

4.3.5 金属离子对酶活的影响

4.3.6 抑制剂对酶活的影响

4.3.7 漆酶的动力学参数

4.4 小结

参考文献

第5章 红芝漆酶对染料脱色的应用研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 漆酶

5.2.2 主要试剂与仪器

5.2.3 染料配制

5.2.4 漆酶的制备

5.2.5 漆酶活力的测定

5.2.6 三种染料的最大吸收波长测定

5.2.7 染料脱色体系建立

5.2.8 脱色率计算

5.3 结果与分析

5.3.1 三种染料的特征吸收波长

5.3.2 漆酶和漆酶/ABTS 介质系统对染料脱色性能的比较

5.3.3 pH 对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.4 反应温度对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.5 ABTS 加入量对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.6 漆酶加入量对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.7 染料浓度对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.8 金属离子对漆酶/ABTS 介质系统脱色染料的影响

5.3.9 染料脱色反应动力学

5.4 小结

参考文献

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

攻读硕士学位期间已发表和待发表论文

致谢