多氯联苯(PCBs)胁迫下红树蚬转录组的初步研究

摘要

PCBs对动物的皮肤、肝脏、神经系统、生殖系统、免疫系统等多个器官系统存在强烈的致病毒性，并且因其稳定性高，难以降解，对生态环境有极大威胁。红树蚬（Polymesodaerosa）为红树林区内优势贝类之一，不进行长距离迁移，易对污染物进行富集，是研究毒理学的理想生物。本文以红树蚬为研究对象，通过分析其COⅠ基因和16SrRNA基因在分子水平确定它的分类地位，利用高通量测序技术分析PCBs胁迫后其肝胰腺和鳃组织的转录组特征，应用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析筛选内参基因，实时荧光定量PCR检验转录组测序的准确性，并初步探讨与氧化磷酸化相关基因作为生物标志物的可能性。本研究的结果如下:
　　(1)蚬科24个物种COⅠ基因的同源序列长373bp，变异位点150个，占40.2％;16SrRNA同源序列长度为393bp，但是变异位点110个，比例为27.9％，说明COⅠ基因蕴含更加丰富的遗传变异方面的信息，具备比16SrRNA基因更加强大的分子系统学分析潜质。Polymesoda erosa与Geloina erosa的遗传距离最小，为11.4％;系统发育树中都是与Geloinaerosa、Geloina expansa成单独一分支，说明分子系统分类结果与早期的分类学专著一致，支持红树蚬使用Geloina coaxans这一学名，将其归于硬壳蚬属(Geloina)。
　　(2)geNorm软件分析结果β-actin表达最稳定。NormFinder软件分析结果外套膜、鳃和肝胰腺组织中β-actin的稳定性最好，闭壳肌组织中β-actin(0.454)表达稳定性略微低于a-tubulin(0.425)排第二位。BestKeeper软件分析结果外套膜和鳃组织中β-actin最稳定，肝胰腺和闭壳肌组织中GAPDH最稳定，β-actin排位第二位。因此，PCBs胁迫下红树蚬外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺组织中β-actin表达稳定，适合作为内参基因用于qRT-PCR。
　　(3)转录组测序结果显示本研究所选择的8个目的基因在肝胰腺、鳃组织内为富集上调表达，实时荧光定量验证结果与转录组测序总体趋势一致，但上调倍数略有差异，表明转录组测序结果准确可信。并发现线粒体内与氧化磷酸化相关的基因对PCBs的响应敏感，可做进一步研究探索它们作为生物标志物的潜力。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 红树蚬概述

1．2 PCBs概述

1．2．1 PCBs的毒理学特征

1．2．2 PCBs的生物富集作用

1．3 生物标志物概述

1．4 存在的问题及本文拟解决的问题

1．5 本研究的目的和意义

第二章 基于线粒体DNA序列探讨红树蚬在蚬科的分类地位

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验主要药品与试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基因组DNA的提取

2．2．2 引物的设计

2．2．3 目标基因片段的PCR扩增

2．2．4 电泳液的配制

2．2．5 PCR扩增产物的检测

2．2．6 数据的处理以及分析

2．3 实验结果与分析

2．3．1 PCR扩增结果与序列特征

2．3．2 种间遗传距离

2．3．3 分子系统分析

2．4 讨论

第三章 PCBs胁迫下红树蚬肝胰腺、鳃组织转录组测序

3．1 实验材料

3．2 建库测序流程

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 多氯联苯胁迫下红树蚬荧光定量PCR内参基因的筛选

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验主要药品和试剂

4．1．3 主要实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 实验动物的胁迫处理

4．2．2 总RNA的提取

4．2．3 RNA质量的鉴定

4．2．4 cDNA第一链的合成

4．2．5 引物的设计、合成

4．2．6 各内参基因目的片段的普通PCR扩增

4．2．7 荧光定量PCR和标准曲线分析

4．2．8 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 总RNA提取质量检测

4．3．2 各内务基因目的片段的普通PCR扩增产物分析

4．3．3 各候选内参基因qRT-PCR分析

4．3．4 内参基因的选择

4．4 讨论

第五章 红树蚬在多氯联苯(PCBs)胁迫下差异表达基因的Q-PCR验证

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验主要药品和试剂

5．1．3 主要实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 实验动物的胁迫处理

5．2．2 总RNA的提取

5．2．3 RNA质量的鉴定

5．2．4 cDNA第一链的合成

5．2．5 引物的设计、合成

5．2．6 目的基因片段的聚合酶链式反应

5．2．7 PCR产物的胶回收、载体连接以及转化大肠杆菌

5．2．8 标准曲线的制作以及目的基因的荧光定量PCR分析

5．2．9 数据的处理

5．3 结果与分析

5．3．1 各目的基因的普通PCR扩增产物电泳图

5．3．2 各上调基因片段的blastx同源比对结果

5．3．3 各目的基因Q-PCR扩增效果检测

5．3．4 PCBs胁迫下各目的基因mRNA表达差异结果

5．4 讨论

第六章 结论

参考文献

研究生期间所发表的论文

致谢

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