野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个与胞外多糖产生相关的基因的鉴定

摘要

野油菜黄单胞菌野菜致病变种（Xcc）是一种能在世界范围内引起十字花科植物致病的革兰氏阴性细菌,其显著特征是能产生胞外多糖（EPS）.该研究中,我们利用转座子Tn5gusA5随机插入诱变Xcc野生型菌株8004,构建了含17,280株突变体的Xcc突变体库.通过热不对称嵌套式PCR（TAIL-PCR）和测序确定了转座子Tn5gusA5插入在Xcc基因组中的位置.通过平板检测的方法,在含2﹪葡萄糖的NYGA平板上从突变体库中筛选到17株胞外多糖缺陷突变体.根据其菌落形态特征,将这些突变体分为3类.在这17株胞外多糖缺陷突变体中,14株突变体中被突变的ORF的注释功能与胞外多糖的产生相关,而另外3株被突变的ORF与胞外多糖的产生的关系尚不清楚.为了验证这3个ORF与胞外多糖的产生有关,我们成功地构建了这3个ORF的缺失突变体.Xcc_114长756bp,通过NCBI中的blast搜索,结果表明其编码产物与一种跨膜蛋白具有较高的同源性,推测可能与多糖的胞外运输有关.

目录

文摘

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第一章： 前言

1.1 植物病原细菌—野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)的概述

1.2 胞外多糖(EPS)和脂多糖(LPS)

1.3 胞外多糖(EPS)的生物合成及调控

1.4 胞外多糖(EPS)与致病性的关系

1.5 无毒基因(avr)与过敏反应和致病基因(hrp)

1.6 胞外多糖(EPS)在致病过程中的作用

1.7 本研究工作的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1菌株、质粒和转座子

2.1.2培养基及培养条件

2.1.3抗生素

2.1.4常用溶液及缓冲液

2.2 方法

2.2.1 DNA的提取、纯化、酶切、连接和转化

2.2.2细菌的接合

2.2.3 PCR方法

2.2.4 ABI DNA自动测序系统测定DNA序列

2.2.5 细菌生长曲线的测定

2.2.6 植株试验

2.2.7 胞外多糖的平板检测

2.2.8 插入突变

2.2.9 标记置换

第三章 实验结果

3.1 突变体库的构建

3.2 EPS缺陷突变体的筛选、分类及致病性检测

3.3 缺失结构体的构建

3.3.1 用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增DNA片段并回收

3.3.2 Km基因的克隆

3.3.3 左片段的定向克隆

3.3.4 右片段与pKL的连接

3.3.5 pKLR的测序

3.3.6 重组质粒pKLR与粘粒载体pLAFR3的连接

3.4 接合子8004/pKLRM和8004：：Km/pPH1 JI的获得

3.5同源双交换的PCR鉴定

3.6 缺失突变体胞外多糖和致病性的检测

3.7 Xcc-114的核苷酸序列及其编码产物的推测

3.8 缺失突变体的生长繁殖

第四章 讨论与分析

4.1 胞外多糖与致病性的关系

4.2 Xcc-114的功能推测

4.3 影响表型的因素

4.4 下一步工作设想

参考文献

致谢