高效苯胺降解细菌GXA7的筛选鉴定及其苯胺双加氧酶基因簇的克隆

摘要

该工作从长期受苯胺污染的废水排放口的活性污泥中筛选到一株高效苯胺降解细菌GXA7,能够在以苯胺为唯一碳源和氮源的无机盐培养基上生长.通过对菌株GXA7在不同温度、pH值,以及培养基中不同苯胺浓度条件下的生长和降解苯胺的情况,我们初步确定了GXA7的最适生长和降解苯胺的温度为32℃~36℃,最适pH值为7.0,苯胺最高的耐受浓度为2500mg/L.通过传统表型分类法及1 6SrDNA编码序列同源性比较分析,我们鉴定该菌株为Delftia sp..通过设计苯胺双加氧酶基因特异引物,以菌株GXA7基因组DNA为模板,PCR扩增出两段与Acinetobacter sp.strai n:YAA plasmid:pYA1 DNA(Accession number:D86080)苯胺双加氧酶基因分别有93％和98%的同源性片断.经Southern杂交验证,PGR扩增产物atd788和atd762可以作为筛选文库的探针.利用粘粒pLAFR3作为载体,制备基因组DNA部分酶切片断,经体外包装、转染E.coliEP1100,在选择培养基平板上获得1万多个重组克隆子,构建了菌株GXA7的基因组粘粒文库.以经<'32>P标记的PCR扩增产物atd788作为探针,菌落原位杂交,得到五个可能的阳性克隆,然后经Southern blotting验证,转化子pGXA240及pGXA310为阳性克隆.亚克隆测序分析,我们初步确认克隆到苯胺双加氧酶基因簇.同时完成了Delftia sp.GXA7苯胺双加氧酶基因簇atdA1A2A3A4全序列的测定,并对其核苷酸及其推导的氨基酸序列进行分析.

目录

文摘

英文文摘

第一章综述

1苯胺特性

2苯胺处理方法

3降解苯胺的微生物

4微生物降解苯胺的生化机理

5苯胺降解相关基因(簇)及其遗传调控

6污染防治中的基因工程

7本文研究内容和试验路线

第二章材料与方法

2.1试验材料

2.2培养基及生长条件

2.3抗生素

2.4溶液、缓冲液和试剂

2.5 DNA的提取

2.6质粒DNA的转化

2.7琼脂糖凝胶电泳

2.8电洗脱法回收DNA片段

2.9试剂盒法快速回收DNA片段

2.10 DNA的连接

2.11 PCR扩增DNA片段

2.12 DNA-DNA杂交

2.13粘粒基因组文库的构建

2.14苯胺的测定

第三章高效苯胺降解菌株的筛选鉴定与特性研究

3.1高效苯胺降解细菌的分离和筛选

3.2菌株GXA7的抗生素抗性检测

3.3菌株GXA7生长和降解苯胺的最佳条件

3.4菌株GXA7的鉴定

3.5讨论

第四章苯胺双加氧酶基因的部分克隆和序列分析

4.1 PCR引物设计

4.2 PCR扩增及序列分析

4.3 Southern杂交验证

4.4讨论

第五章GXA7基因组粘粒文库的构建和苯胺双加氧酶基因簇的克隆

5.1基因组DNA部分酶切片断的制备

5.2 GXA7基因组粘粒文库的构建

5.3基因组文库的菌落原位杂交及Southern blotting验证

5.4 pGXA240亚克隆测序分析

5.5讨论

第六章GXA7苯胺双加氧酶基因簇的核苷酸序列分析

6.1 pGXA502次级克隆及其序列测定

6.2 5159bp片断的核苷酸及推导的氨基酸序列分析

6.3讨论

第七章总结与讨论

7.1本论文的工作总结包括

7.2本研究的后续工作包括

参考文献

致 谢