两株抗苯菌灵稻瘟病菌突变体的若干特性

摘要

本研究构建了由稻瘟病菌gpd基因启动子和终止子序列控制的以Neurosporacrassa的微管蛋白β-tubulin(Bm1)突变基因为选择标记的表达载体。用该质粒转化稻瘟病菌0742野生型菌株，获得了两株具有苯菌灵抗性的菌株M1和M2。但southern杂交表明，这两个菌株并不是由于质粒转化而获得苯菌灵抗性。对稻瘟病菌0742野生型及突变体M1、M2的β-tubulin基因的序列比对分析表明，突变体M1在内源β-tubulin基因的第56、178、1704位置上发生了点突变，M2在第56、899、1040、1389、1704位置上发生了点突变，导致M1的352位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸，M2的107、154、270、352位氨基酸分别由苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸变为丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸。计算机分析显示M1和M2突变体β-tubulin基因编码的蛋白质疏水性发生了微弱改变。该发现为开发新的稻瘟病菌遗传选择标记提供了依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1稻瘟病与稻瘟病菌

1.1稻瘟病的研究历史

1.2稻瘟病的症状

1.3稻瘟病的危害

1.4稻瘟病菌的命名

1.5稻瘟病菌的生理特性

1.6稻瘟病的发病规律及侵染周期

1.7稻瘟病菌的生理小种

1.8稻瘟病菌有性世代的研究进展

2稻瘟病菌的分子遗传学研究进展

2.1稻瘟病菌基因组学研究进展

2.2稻瘟病菌无毒基因的克隆

2.3水稻抗稻瘟病基因的研究

2.4稻瘟病菌致病相关基因研究进展

3真菌的遗传转化体系

3.1真菌的遗传选择标记

3.2真菌转化中的整合质粒与非整合质粒

3.3真菌的转化方法

4稻瘟病菌转化体系的建立

5本研究的范同、项目来源、目的、意义

第二章材料和方法

1菌种

1.1细菌菌种

1.2真菌菌种

2培养基及培养条件

2.1大肠杆菌培养基

2.2稻瘟病菌培养基

2.3菌株培养条件

3抗生素及其使用浓度

4质粒DNA的小规模提取

5 DNA的酶切

6 DNA片段的回收

6.1用低熔点琼脂糖凝胶回收DNA片段

6.2电透析法回收DNA片段

6.3采用DNA回收试剂盒

7 DNA的连接反应

8 PCR

9质粒DNA的转化

9.1甘油法制备E. coli的感受态细胞

9.2氯化铷法制备大肠杆菌感受态细胞

9.3质粒DNA的电脉冲转化

9.4质粒DNA的热击转化

10稻瘟病菌总DNA的提取

11稻瘟病菌原生质体的制备

12原生质体的再生

13 Southern杂交

13.1向下毛细管转移法进行Southern印迹

13.2 DNA印迹的杂交分析

第三章结果与分析

1稻瘟病菌gpd基因启动子和终止子的克隆

2 3zf(+)-gpd质粒的构建及两株抗苯菌灵的稻瘟病菌突变体的获得

2.1将PCR扩增得到的Pgpd、Tgpd和Bnr片段与pGEM-3zf(+)vector连接

2.2将3zf(+)-gpd质粒转入稻瘟病菌0742原生质体

3两株抗苯菌灵的稻瘟病菌突变体的特性研究

3.1生理特性

3.2杂交分析

3.3稻瘟病菌0742与突变体M1、M2 β-tubulin基因的克隆

3.4 β-tubulin基因的核苷酸序列分析

3.5稻瘟菌β-tubulin基因编码的蛋白产物特性

第四章讨论

参考文献

附录1实验中用到的主要仪器

致谢