十字花科黑腐病菌锌吸收调控蛋白基因zur启动子的研究

摘要

在细菌中，锌吸收调控蛋白Zur(zinc uptake regulator)(由zur基因编码)的主要功能是当细胞内锌离子浓度过高时抑制锌吸收系统的表达。但是，本实验室的研究表明，在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．campestris)中，zur(基因编号为XC1430)除了调控锌离子平衡外，还参与了该菌的致病过程和EPS产生。在完成zur基因的功能鉴定后，本实验室还对zur基因的启动子进行了初步研究，推测zur基因可能存在两个独立的启动子P1(基因组注释的ATG前面114 bp)和P2(基因组注释的zur基因读码框内，ATG下游63 bp处的另一个翻译起始密码子GTG前108 bp)。为了证实这一假设，本研究分别构建了启动子P1和P2与无启动子gusA基因的融合报告质粒pL6PlgusA和pL6P2gusA，并检测它们在野生型菌株8004中的GUS活性，结果表明，P1和P2均有启动子活性；进一步的实验研究结果表明P1和P2的表达均不受锌离子的影响。为了确定P1和P2的转录起始位点，我们进行了5'-RACE实验，结果表明在ATG上游23 bp处的A碱基是P1的转录起始位点，但是在我们所用的实验条件下没有检测到P2的转录起始位点。 由于GUS活性结果表明P1和P2都具有启动子活性，因此我们推测zur既可以从ATG起始也可以从GTG起始翻译，分别编码两种Zur蛋白即ZurL(从ATG起始)和ZurS(从GTG起始)。为了证实这一点，我们分别构建了带有翻译起始密码子ATG→ATA和GTG→GTA点突变的zur基因的质粒pL6zurATG和pL6zurGTG并分别导入zur的缺失突变体中，然后对点突变互补菌进行锌敏感性、EPS产量以及致病性进行检测。结果发现，将GTG点突变后(只能合成ZurL蛋白)，重组质粒pL6zurATG可以互补zur突变体的锌敏感、致病力和EPS合成表型；而将ATG点突变后(只能合成ZurS蛋白)，重组质粒pL6zurGTG可以互补突变体的致病力、EPS合成而不能互补其锌敏感表型，表明从ATG起始或从GTG起始编码的蛋白均有生物学功能，且在功能有交叉也有差异：从ATG起始编码的蛋白ZurL具有锌平衡、EPS合成、致病调控功能，而从GTG起始编码的蛋白ZurS，只有EPS合成、致病调控功能而没有锌平衡功能。为了进一步鉴定ZurL和ZurS蛋白是否存在，我们在NYGB培养条件下对点突变互补菌株和缺失突变体菌株的Zur蛋白进行了Western blotting检测，结果发现在点突变体菌株的细胞提取物均能检测到一条杂交带，而在缺失突变体菌株的细胞提取物中未能检测到杂交带，其结果表明在各自的点突变互补菌株中ZurL和ZurS是存在的，其结果与点突变体的表型检测结果相符。但Western blotting检测野生型菌株Xcc 8004的细胞提取物时，未能检测到两条杂交带。 以上这些结果证明，(1)除了ATG前面的启动子(P1)外，zur基因读码框内GTG上游-108 bp区域(P2)具有启动子活性；(2)从ATG起始编码的蛋白ZurL具有锌平衡、EPS合成、致病调控功能，而从GTG起始编码的蛋白ZurS，只有EPS合成、致病调控功能而没有锌平衡功能。 但在所用的实验条件下，用Western blotting未能检测到Xcc 8004细胞内有两种Zur蛋白。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1十字花科黑腐病菌及其致病机理研究进展

1.1.1十字花科黑腐病菌

1.1.2十字花科黑腐病菌的致病因子

1.2细菌的锌代谢平衡机制及调控研究进展

1.2.1细菌的锌离子排放系统及其调控

1.2.2细菌的锌离子吸收系统及其调控

1.2.3锌吸收调控蛋白(Zur)的研究进展

1.2.4十字花科黑腐病菌8004的zur基因

1.3本工作的目的与内容

第二章材料与方法

2.1菌株和质粒

2.2常用抗生素和其它试剂

2.3培养基

2.4溶液与缓冲液

2.5实验所用菌株的培养条件和保存方法

2.6常规PCR反应

2.7融合PCR反应

2.8琼脂糖凝胶电泳

2.9 PCR产物的回收与纯化

2.10限制性内切酶酶切

2.11 DNA连接

2.12电脉冲感受态细胞的制备

2.14三亲本接合

2.16质粒的提取

2.17胞外多糖的检测

2.18植株的致病性实验

2.19锌敏感性实验

2.20 GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测

2.21总蛋白的提取

2.22 Western blotting

2.24 Xcc总RNA的提取及去除DNA污染

2.25 5'-RACE

2.26 zur缺失突变体的构建

2.27缺失突变体的互补

第三章结果与分析

3.1 P1和P2均有启动子活性

3.1.1启动子与gusA基因转录融合报告质粒的构建

3.1.2报告质粒的GUS活性

3.2启动子Pl和P2的表达不受锌离子的影响

3.3 zur转录起始位点的确定

3.4 zur可能编码两个功能不同的蛋白

3.4.1缺失突变体的构建

3.4.2缺失突变体互补菌株的构建

3.4.3起始密码子点突变互补菌株的构建

3.4.4点突变互补菌株的锌敏感检测

3.4.5点突变互补菌株的致病性检测

3.4.6点突变互补菌株的EPS产量检测

3.4.7 zur是否编码两个蛋白的Western blotting验证

第四章结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1关于zur缺失突变体的构建

4.2.2关于两个起始密码子突变所用的点突变方法

4.2.3关于Xcc 8004中zur的启动子

4.2.4关于Xcc 8004中锌离子对zur表达的影响

4.2.5关于细菌中一个基因编码多个蛋白的现象

4.2.6关于ZurL和ZurS

参考文献

致谢