2006-2007年广西狂犬病病毒的检测及N、G基因的测序分析

摘要

目的：近年来，广西已经成为我国狂犬病发病数最高的省份，而犬是狂犬病病毒最主要的带毒宿主。调查广西犬中狂犬病病毒的带毒情况，分析其遗传进化特点，为制定合理的疫苗有效控制狂犬病疫情提供科学依据。 方法：本研究对2006-2007年采自广两12个市的485份犬脑材料、387份唾液材料，进行RT-PCR检测和小鼠脑内接种分离，并对病毒的核蛋白和糖蛋白基因进行测序，序列用生物软件DNASTAR进行核苷酸和氨基酸同源性比较和遗传进化树分析。 结果：一共分离到11株狂犬病病毒，其中脑组织11株，其中有一株从脑组织和唾液均分离到狂犬病病毒。通过生物软件分析，11株狂犬病毒株可以分为两十群。其中l群毒株包括GXNND(T)、GXHXB、GXLAll、GXQZD，Ⅱ群毒株包括GXLC9、GXPL、GXLCC、GXYZD、GXAll、GXNN2、GXPXD。11株病毒N基因核苷酸同源性89．0％-99．9％，氨基酸同源性97．8％-99．8％。Ⅰ群的N蛋A主要氨基酸位点变异在90、110、332、397位，而Ⅱ群则主要在42位和332位，且两个群在这些位点的变异与同群参考毒株完全一致，具有群的特异性。11株G基因核苷酸同源性在86.9％-99．9％，氧基酸吲源性在93.9％-99．8％。G蛋白的氨基酸的变异主要发生在信号肽与成熟肽，其信号肽与成熟肽的变异也具有群的著异性，Ⅰ群主要的变异位点在第-6、-7、96、132、156、436、443、447位；Ⅱ群主要的变异位点在第-4、-5、-15、-18、90、156、168、204、249、253、289、332、382、427、443、463、474、486、487位。这11株的N P主要抗原位点没有发生变异，Ⅰ群磷酸化位点Ser389也没有变化，且Th细胞表位的氨基酸十分保守。这11株的G P蛋白只有37位和319位两个糖基化位点。抗原位点GⅠ、GⅡ、GⅢ仅有Ⅱ群毒株的GⅢ的332位缬氨酸变异为异亮氨酸。 从地域分布看，本研究分离的毒株大多来自南宁和柳州，Ⅱ群主要分布在的桂西一带，Ⅰ群主要在桂东地区。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1狂犬病病毒的宿主

2中国狂犬病流行概述

2.1我国狂犬病的分布及流行情况

2.2广西狂犬病分布和流行情况

3狂犬病病毒的分子生物学特性

3.1狂犬病毒基因组结构

3.2狂犬病毒核蛋白的研究进展

3.3狂犬病毒糖蛋白的研究进展

4狂犬病在分子流行病学方面的研究进展

5 诊断

6核蛋白与糖蛋白在疫苗研究中的应用

6.1亚单位疫苗

6.2载体疫苗

6.3基因疫苗

6.4植物表达系统疫苗

7目的与意义

一材料与方法

1.1材料

1.1.1病料

1.1.2试验动物

1.1.3仪器和试剂

1.1.4试剂的配制

1.1.5感受态细胞的制备(CaCI2改良法)

1.1.6比较用的相关毒株的来源

1.1.7引物的设计

1.2方法

1.2.1实验路线

1.2.2犬脑组织材料及唾液材料的处理

1.2.3病毒RNA的提取

1.2.4犬脑组织阳性诊断(RHN1/RHN2):反转录-聚合酶链式反应产(RT-PCR)

1.2.5小白鼠脑内攻毒试验

1.2.6鼠脑组织病毒RNA提取

1.2.7狂犬病病毒N基因的扩增(RHN3/RHN4)

1.2.8狂犬病病毒G基因的扩增(GP1/GP2)

1.2.9 PCR产物胶回收(按照胶回收试剂盒说明进行)

1.2.10 连接

1.2.11转化

1.2.12抽提质粒

1.2.13重组质粒酶切鉴定

1.2.14测序和序列分析

二实验结果

2.1犬脑组织材料和唾液材料RV检测结果

2.2小白鼠脑内接种试验结果

2.3狂犬病毒N基因克隆及序列分析

2.3.1狂犬病毒N基因的扩增

2.3.2对重组质粒的酶切鉴定

2.3.3 N基因序列比对

2.3.4 N基因的遗传进化树分析

2.3.5 N蛋白氨基酸变异

2.3.6 NP主要抗原表位和Th细胞表位的氨基酸比较

2.4狂犬病毒G基因克隆及序列分析

三讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表论文