一种基于Bn-Km抗性的微紫青霉菌菌株GXCR的插入诱变载体的构建

摘要

目前，重金属污染已成为环境中的重要污染物之一，也是全世界普遍关注的环境问题。丝状真菌具有坚硬的几丁质细胞壁、孢子繁殖、基因组相对较小等形态学和生理学特征成为重金属污染的生物修复的理想对象。阐明丝状真菌重金属的抗性机制研究其基因功能显得尤为重要，而研究基因功能最直接简便的方法是反向遗传学法，它是通过遗传转化的方法构建覆盖整个基因组的突变体库，根据突所造成的表型分析从而确定基因的功能。近年来在真菌中发展的根癌农杆菌介导的遗传转化具有高效、稳定、高频单拷贝随机插入、适用范围广、成本低、操作方便和重复性好等特点，成为当前研究丝状真菌基因功能的主要工具之一。
　　 本实验室曾分离得到一株高抗多种重金属盐且对苯菌灵敏感的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR，本研究在质粒pG-Bn（本实验室构建的T-DNA区已插入苯菌灵抗性基因的载体）的基础上在其T-DNA区再插入卡那霉素抗性基因，构建插入诱变载体命名为pG-Bn-Km，再由根癌农杆菌LBA4404介导产生GXCR菌株的插入突变体。从乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养的时间、共培养的温度、受体菌孢子的浓度、农杆菌的浓度、共培养的pH值6个因素设计正交实验，求解该菌的最优转化条件，为今后通过插入诱变大规模鉴定该菌的的基因功能奠定基础。其转化的最适条件为AS浓度100μmol/L、农杆菌OD600=0.45、GXCR孢子浓度106个/ml、共培养温度32℃、共培养的pH=5.4、共培养60 hr，在此条件下，平均每106个GXCR孢子可以得到530-650个Bn抗性转化子。随机抽出30个转化株进行PCR检测，初步表明pG-Bn-Km已插入GXCR染色体中。转化子经7次转接后Bn抗性稳定。在200mM/400 mM的CuS04的PDA上筛选到到1株Cu2+抗性下降的转化株，经过形态学与ITS序列分析表明该转化株是野生型GXCR的突变体，命名为A-1。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章材料、方法

2.1材料及各种试剂

2.1.1菌株、质粒、载体

2.1.2抗生素及使用浓度

2.1.3培养基及培养条件

2.1.4使用试剂

2.1.5实验所需各种溶液

2.1.6实验中用到的主要仪器与设备

2.1.7本论文所用到的引物

2.2方法

2.2.1碱变性裂解法质粒DNA的少量提取

2.2.2 DNA的酶切反应

2.2.3 DNA片段的回收

2.2.4 DNA的连接反应

2.2.5质粒DNA的转化

2.2.6 PCR反应

2.2.7 PCR产物回收

2.2.8 PCR产物的克隆

2.2.9 DNA的测序

2.2.10将构建好的pG-Bn-Km插入诱变载体,利用三亲结合法导入受体菌--农杆菌LBA4404

2.2.11根癌农杆菌质粒DNA的提取

2.2.12根癌农杆菌LBA4404介导的转化体系的优化

2.2.13微紫青霉菌(Penicillium janthinillum)菌株GXCR转化株总DNA的提取

2.2.14农杆菌LBA4-404介导的GXCR转化效率的检测

2.2.15转化株总DNA的PCR验证

2.2.16转化株的遗传稳定性检测

2.2.17转化株的抗重金属能力变化分析

2.2.18抗铜(CuSO4)能力下降突变体转化株的鉴定

第三章结果与分析

3.1酶切和PCR对表达载体pG-Bn中Bn基因的检测

3.2插入诱变插入诱变载体的构建

3.2.1载体、质粒的酶切位点分析和引物的获得

3.2.2 Km基因的克隆

3.2.3 BgIⅡ和Spe Ⅰ双酶切后的Km基因连接到表达载体pG-Bn

3.3将构建好的插入诱变载体pG-Bn-Km导入根癌农杆菌LBA4404

3.4含有pG-Bn-Km插入诱变诱变载体的根癌农杆菌LBA4404介导微紫青霉菌(Penicillium janthinillum)菌株GXCR转化体系的建立

3.5转化株的鉴定

3.5.1转化株的PCR检测

3.5.2转化株的稳定性检测

3.5.3转化株的抗铜(CuSO4)能力分析

3.6抗铜(CuSO4)能力下降突变体转化株A-1的鉴定

3.6.1形态学检测

3.6.2 ITS序列分析

第四章讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文发表情况