利用间歇浸没式生物反应器(TIBs)进行甘蔗组培及组培苗酚类物质作用的研究

摘要

间歇浸没式生物反应器(TIBs)是近年来国际上新研究开发的一种用于植物组织培养和植物次生代谢产物研究的系统。大量的报道己证实此系统与传统植物组培技术相比具有明显的优势。本文以甘蔗在TIBs组培快繁为基础进行了以下三个方面的研究:
　　 1.利用TIBs进行甘蔗的组培快繁研究
　　 以ROC22和Badila的茎尖脱毒组培苗为材料,开展了利用TIBsi进行组培快繁的技术体系的研究。结果表明:(1)利用TIBs进行甘蔗组织培养一代增殖是传统方法的的10倍以上,其中Badila的增殖能力比ROC22强;(2)两个品种TIBs组培以到第3或者第4代继代材料为宜;(3)两个品种接种密度在10-15株/L培养基最有利于甘蔗组培苗的增殖和生长;(4)TIBs中6-BA浓度为0.5-1.0 mg/L时适合于增殖培养,NAA浓度为4 mg/L时有利于根的诱导;(5)两个品种的浸没间歇频率在1 min/3 h时增殖和生长表现比较优异,1 min/6 h时则有利于根的诱导和根的生长;TIBs组培苗的总苗数移栽成活率低于传统方法,而超过5 cm高的组培苗的移栽成活率都在85％以上,两种培养方式的移栽成活率差异不明显。
　　 2.TIBs甘蔗组培快繁过程中组培苗产生的多酚类物质对组培苗生长的影响
　　 以Badila茎尖脱毒组培苗为材料,培养基中添加5 mg/L的抗坏血酸为处理,以正常组培为对照。利用Cdna-AFLP技术分析了两种条件下甘蔗组培苗的基因差异表达。结果使用256对引物组合扩增出大约17400条带,其中有64条处理与对照之间具有明显差异,经过对回收差异片段进行反向Northern杂交验证排除假阳性后,50个片段的表达方式与Cdna-AFLP分析结果是一致的,即对照和处理之间的表达具有明显的差异。有36条带在对照(不添加抗坏血酸)中表达增强,占总代数的72％;有8条带在对照与处理在表达时间上不一致,占总带数的16％,对照在培养15 d时表达,而处理的在25 d时表达;还有6差异条带为添加抗坏血酸处理中表达减弱,占总带数的12％。对50条特异性片段回收,克隆并成功测序后所得的结果与GenBank数据库中的所有序列进行Blastx和Blastn比对分析,得到的序列信息按功能分类可以分为8类:与细胞代谢与发育相关,20％;与胁迫反应相关,18％;与茉莉酸信号途径相关,10％;与苯基丙酸类合成路径相关,14％;与生长素类相关,6％;与氧化反应途径相关,6％;与乙烯信号传导相关,10％;未知功能基因,16％。
　　 3.利用TIBs进行甘蔗组培快繁过程中产生的多酚类物质进行诱导番茄抗青枯病的研究
　　 本试验利用TIBs进行甘蔗Badila,组培快繁过程中产生的多酚类物质进行诱导番茄(亚蔬2301)抗青枯病的研究,主要分析了:(1)多酚类物质的种类;(2)多酚类物质进行诱导番茄抗青枯病的过程中番茄体内几种保护酶(PAL、POD、SOD)、总酚含量和木质素含量的变化;(3)多酚类物质进行诱导番茄抗青枯病的过程中番茄一些与抗性相关的基因表达情况。
　　 本试验采用固相微萃取技术与硅烷衍生化法结合气相色谱与质谱联用联用来分析培养基中多酚类物质的种类,共得到6种多酚类物质,按其峰面积从大到小排列顺序分别为:间丙烯酸苯酚;3-(2-含氧甲基苯酚)-2,4-二甲基戊醇;2-含氧甲基苯酚;2,6-二异丁基-4-甲基苯酚;4-4'-亚甲基(2,3,6-三甲基苯酚);4,4'-亚甲基联苯酚。其中间丙烯酸苯酚为一种酚酸类物质,与水杨酸(SA)化学结构式相似。
　　 TIBs进行甘蔗组培快繁过程中组培苗产生的多酚类物质具有一定的诱导番茄抗青枯病的能力,对番茄的青枯病防治有一定的效果,接种青枯病菌的番茄经过TIBs甘蔗组培快繁过程中组培苗产生的多酚类物质进行诱导处理后与未经诱导处理的相比,提高了根和叶片中的PAL、POD、SOD活性,与其他处理相比这些保护酶出现的时间较早且维持时间较长;同样经过诱导处理后番茄根和叶片中的总酚含量和木质素的含量也比未经诱导处理的高。
　　 利用RT-PCR技术对选取的一些与抗性相关的基因片段的表达分析显示:甘蔗增殖培养基诱导处理能够促进感青枯病的番茄植株内与抗性相关的基因的表达,并能维持相对较长的一段时间,说明利用TIBs进行组培快繁中甘蔗组培苗产生的多酚类物质在诱导番茄青枯病抗性的过程中,激活了番茄体内的抗病系统,从而加速了抗性应答产生。