十字花科黑腐病菌十二个小RNA的功能鉴定

摘要

细菌小RNA(small RNA，sRNAs)，又被称为非编码小RNA(non-coding RNA，ncRNAs)，是指大小一般在50-500nt之间，不编码蛋白质，能独立行使一定的功能但又不同于核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)的RNA分子。研究发现小RNA广泛存在于各种生物中，它们作为转录后调控因子在细菌的碳源代谢、铁代谢、群体感应、应激反应、以及致病过程等过程中发挥重要的调控作用。目前，尽管小RNA在动物/人的病原细菌的致病过程中的重要性已得到充分确认，但它们在植物病原细菌的致病过程中的作用还未被广泛认知。
　　 最近，本实验室采用RNA深度测序(deep RNA sequencing)方法在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)8004菌株(以下称Xcc8004)中进行了小RNA鉴定，发现了几百个候选小RNA，其中80多个已经通过Northern杂交及RT-PCR(reverse transcription-PCR验证。为了研究这些小RNA的功能，在本研究中通过构建缺失突变体及过量表达株的方式，研究了十二个小RNA(sRNA-Xcc7，sRNA-Xcc8，sRNA-Xcc9，sRNA-Xcc10，sRNA-Xcc11，sRNA-Xcc12，sRNA-Xcc13，sRNA-Xcc14，sRNA-Xcc15，sRNA-Xcc16，sRNA-Xcc17和sRNA-Xcc18)的生物学功能。到目前为止已经获得了四个小RNA(sRNA-Xcc7，sRNA-Xcc8，sRNA-Xcc9和sRNA-Xcc10)的缺失突变体以及九个小RNA(sRNA-Xcc9，sRNA-Xcc11，sRNA-Xcc12，sRNA-Xcc13，sRNA-Xcc14，sRNA-Xcc15，sRNA-Xcc16，sRNA-Xcc17和sRNA-Xcc18)的过量表达株，并分别检测了这些小RNA缺失突变体和过量表达株在基本培养基上的生长状况、胞外酶活性、胞外多糖产量、致病性、HR反应、游动能力和聚集生长情况、金属离子耐受性、耐渗透压能力、对蛋白质变性剂的耐受能力等表型。结果发现：(1)sRNA-Xcc9的缺失突变体及其过表达株的致病力比野生型菌株显著下降；(2)sRNA-Xcc9的过量表达株的胞外淀粉酶及胞外蛋白酶活性比野生型菌株显著下降，但其它表型与野生型菌株无明显差异；(3)sRNA-Xcc17的过量表达株的胞外淀粉酶活性比野生型菌株显著下降，其它表型与野生型菌株无明显差异；(4)sRNA-Xcc7，sRNA-Xcc8，sRNA-Xcc10的缺失突变体，及sRNA-Xcc11，sRNA-Xcc12，sRNA-Xcc13，sRNA-Xcc14，sRNA-Xcc15，sRNA-Xcc16，sRNA-Xcc18的过量表达株的表型和野生型菌株无明显差异。这些结果说明：(1)小RNA sRNA-Xcc9可能参与Xcc的致病以及胞外淀粉酶和胞外蛋白酶的产生过程；(2)小RNA sRNA-Xcc17可能参与Xcc的胞外淀粉酶的产生过程。
　　 本研究为深入研究sRNA-Xcc9，sRNA-Xcc17的功能以及其作用机理奠定了的基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 细菌小RNA简介

1.2 细菌小RNA的发现

1.3 细菌小RNA的筛选与鉴定

1.4 细菌小RNA的分类

1.5 细菌小RNA的生物学功能

1.5.1 细菌小RNA在碳源代谢过程中的调控作用

1.5.2 细菌小RNA在铁代谢平衡过程中的调控作用

1.5.3 细菌小RNA在群体感应中的调控作用

1.5.4 细菌小RNA在细胞膜应激反应过程中的调控作用

1.5.5 细菌小RNA在致病过程中的调控作用

1.6 小RNA的结构分析和靶标预测

1.7 黄单胞菌小RNA研究进展

1.7.1 黄单胞菌简介

1.7.2 黄单胞菌中的小RNA

1.8 本课题研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 本研究所用质粒及菌株

2.2 抗生素及其它试剂

2.3 本研究所用引物

2.4 本研究所用培养基及菌种活化、保存

2.5 本研究所用试剂及缓冲溶液

2.6 实验操作方法

2.6.1 细菌DNA的提取

2.6.2 质粒DNA的提取

2.6.3 琼脂糖凝胶电泳

2.6.4 常规PCR扩增反应

2.6.5 DNA片段的胶回收与纯化

2.6.6 DNA的酶切

2.6.7 DNA的连接

2.6.8 质粒DNA的转化

2.6.9 三亲接合实验

2.6.10 突变体构建

2.6.11 SDS-酸酚法提取Xcc总RNA

2.6.12 总RNA的DNA消化处理

2.6.13 cDNA第一链合成

2.6.14 RT-PCR

2.6.15 表型检测

第三章 结果与分析讨论

3.1 本研究中的小RNA

3.2 小RNA缺失突变体的构建

3.3 小RNA过量表达株构建

3.4 小RNA缺失突变体及过量表达株在基本培养基中的生长情况分析

3.5 小RNA缺失突变体及过量表达株的胞外酶活性及胞外多糖产量分析

3.6 小RNA缺失突变体及过量表达株的致病力分析

3.7 小RNA缺失突变体及过量表达株HR反应分析

3.8 小RNA缺失突变体及过量表达株聚集生长情况和游动能力分析

3.9 小RNA缺失突变体及过量表达株对Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+的耐受力 分析

3.10 小RNA缺失突变体及过量表达株对NaCl及SDS的耐受能力分析

3.11 总结

3.12 讨论与分析

3.13 后续工作

参考文献

致谢