低温胁迫下甘蔗后期生理特性及差异蛋白质组学研究

摘要

甘蔗（Saccharum officenarum L.）为禾本科甘蔗属植物，属于热带、亚热带作物，其光合效率高，光饱和点高，而二氧化碳补偿点低，光呼吸率低，光合强度大，以蔗茎为收获物，因此生物产量和经济产量高。但甘蔗对自然资源有一定的要求，特别是对温度和水分。在我国，近年来气候变化异常，极端低温频发，在甘蔗的生长后期常遭受自然低温伤害，低温使甘蔗生产和制糖工业生产的发展受严重影响，导致不同程度的经济损失。本研究采用自然低温从生理生化水平对其品种的抗寒性进行比较研究，探讨各指标与抗寒性的关系，运用蛋白质组学方法比较甘蔗在低温胁迫下的蛋白质表达情况，利用同源克隆等技术对一些抗寒基因进行克隆和表达分析，所获主要结果如下:
　　 1.在大田自然低温条件下，以21个常规甘蔗品种作为材料，研究不同甘蔗品种在遭受长时间持续低温时的形态和生理生化特性的变化，结果表明:在长时间自然低温胁迫下，甘蔗叶片、生长点、侧芽、蔗茎均受到不同程度伤害;甘蔗在自然降温过程中，不同甘蔗品种的生理指标反应程度各异，叶绿素受寒害后前期降解慢，后期降解逐渐加剧，可溶性糖含量因品种抗寒性不同而表现不一，可溶性蛋白质在低温持续时表现迟钝，脯氨酸和丙二醛(MDA)含量在低温中增加，但因品种抗寒性不同而积累量不同。选择多个生理生化指标，采用模糊隶属函数法，将供试品种抗寒性划分为高抗寒型、抗寒型和低抗寒型3级。
　　 2.利用双向电泳技术，选取抗寒性差异大的2个品种桂糖28号和园林6号作为材料，研究低温胁迫对甘蔗生长后期的茎尖蛋白质的差异表达情况。结果表明:经PDQuest软件对蛋白质2-DE图谱进行分析，检测到1000多个有效蛋白点，并找到蛋白质丰度变化在2倍以上的蛋白点45个，部分蛋白点呈现上调表达，而部分蛋白点呈现下调表达，因品种抗性不同而表现各异。推测甘蔗在低温胁迫条件下，蛋白质丰度呈动态性变化。
　　 3.运用质谱技术，研究了低温胁迫对甘蔗生长后期茎尖中差异表达的45个蛋白质点，进行了质谱鉴定和生物信息分析，结果表明:45个差异蛋白点经质谱鉴定后，有35个蛋白点被成功鉴定。对所鉴定的蛋白质根据功能分类分为7类。其中参与自由基清除的7个;参与光合作用3个;参与细胞信号转导3个;参与蛋白加工5个;参与细胞生长和分裂2个;参与基础代谢（包括糖代谢、氮代谢、碳代谢、能量代谢、次生代谢以及RNA加工等）11个;未知功能蛋白4个。甘蔗对低温胁迫应答机制是一个涉及多系统、多水平的综合过程。
　　 4.采用RT-PCR和同源克隆技术，克隆获得了甘蔗过氧化物酶基因（SoPOD1）、甘蔗20S蛋白酶体α亚基基因(So20S)、甘蔗α-微管蛋白基因（So TUA）以及5个甘蔗钙调磷酸酶B类似蛋白家族基因（SoCBL1，SoCBL3，SoCBL5，SoCBL6和SoCBL9）的eDNA全长。利用qRT-PCR技术研究了上述基因在低温胁迫下在不同抗性甘蔗品种中的的动态表达情况。在低温胁迫下，两个甘蔗品种SoPOD1基因表达先升高后降低，但抗寒强的GT28品种SoPOD1基因表达量上升速度要比不抗寒品种YL6快;So20基因的表达在两个甘蔗品种中的变化不一，在GT28中其变化趋势为先升后降，在YL6中其变化趋势为缓慢升高;SoTUA在两个品种中的变化总体上趋势一致，但在含量上，GT28中的表达量明显要高于在YL6中的; SoCBL1和SoCBL9基因的表达水平在两个品种中是基本一致;SoCBL3在抗寒的GT28品种中表达量出现明显下降，在YL6品种则呈先上升后急剧下降趋势;SoCBL5的表达水平在两个品种总体出现下降趋势，而SoCBL6基因在GT28和YL6品种在低温胁迫下的表达趋势为上升，即使是继续低温，基因的表达水平有所下降，但仍高于对照。CBL家族成员中起作用的关键基因有可能是SoCBL6和SoCBL5。以上基因都在甘蔗低温胁迫下有一定的应答反应，其基因的功能不同，所在低温胁迫过程中参与的防御途径也不相同，为加强甘蔗抵御低温胁迫及其它非生物胁迫提供了重要的理论基础。

目录

声明

摘要

缩写表

1 综述

1．1 引言

1．2 植物抗寒性与形态结构

1．3 植物抗寒性的生理生化基础

1．3．1 低温胁迫与植物细胞膜体系

1．3．2 低温胁迫与植物叶绿体生理和光合作用

1．3．3 低温胁迫与植物渗透调节物质

1．3．4 低温胁迫与植物保护酶活性

1．4 植物低温胁迫的分子生物学

1．4．1 低温胁迫与蛋白质组学

1．4．2 低温胁迫与抗寒基因

1．5 研究的目的和意义

2 自然低温对不同甘蔗品种形态与生理生化特性的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 试验地概况

2．1．2 试验材料

2．1．3 采样时间和方法

2．1．4 试验方法

2．1．5 数据处理与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 自然降温过程中甘蔗的受害症状

2．2．2 低温对叶绿素含量的影响

2．2．3 低温对可溶性糖含量的影响

2．2．4 低温对可溶性蛋白质含量的影响

2．2．5 低温对游离氨基酸含量的影响

2．2．6 低温对脯氨酸含量的影响

2．2．7 低温对丙二醛含量的影响

2．2．8 不同甘蔗品种抗寒性综合分析

2．2．9 抗寒指标间的相关性

2．2．10 利用隶属函数评价甘蔗抗寒性

2．3 讨论

2．3．1 自然低温对甘蔗后期叶片叶绿素的影响

2．3．2 自然低温对甘蔗后期叶片渗透调节物的影响

2．3．3 自然低温对甘蔗后期叶片MDA的影响

2．3．4 自然低温下大田甘蔗品种抗寒性比较的综合评价方法

2．4 小结

3 低温胁迫对甘蔗后期蛋白质的双向电泳及图谱分析

3．1 材料与方法

3．1．1 供试品种

3．1．2 材料处理与采样

3．1．3 主要生化试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 样品蛋白质的提取

3．1．6 蛋白的溶解和定量

3．1．7 双向凝胶电泳

3．1．8 染色、脱色

3．1．9 图像扫描和分析

3．2 结果与分析

3．2．1 低温胁迫下甘蔗生长后期茎尖蛋白质的双向电泳分析

3．2．2 低温胁迫条件下差异表达蛋白质的丰度变化

3．3 讨论

3．4 小结

4 低温胁迫下差异蛋白的质谱鉴定和功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 供试品种

4．1．2 材料处理与采样

4．1．3 蛋白质双向电泳、染色和图像扫描

4．1．4 差异蛋白点的质谱样品制备

4．1．5 蛋白样品的质谱检测

4．1．6 生物信息学分析

4．2 结果与分析

4．2．1 部分差异表达蛋白质的质谱鉴定结果

4．2．2 低温胁迫下鉴定的差异表达蛋白质功能分类

4．3 讨论

4．3．1 参与光合作用相关蛋白

4．3．2 参与细胞防御相关蛋白

4．3．3 参与蛋白加工相关蛋白

4．3．4 参与代谢的相关蛋白

4．3．5 参与信号转导相关蛋白

4．4 小结

5 低温胁迫差异基因的克隆与表达分析

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料与处理

5．1．2 试验试剂

5．1．3 主要仪器

5．1．4 甘蔗总RNA提取及检测

5．1．5 cDNA第一链合成

5．1．6 基因cDNA全长获得

5．1．7 序列分析

5．1．8 基因的实时荧光定量表达分析

5．2 结果与分析

5．2．1 甘蔗叶片总RNA及cDNA质量

5．2．2 甘蔗抗寒相关基因cDNA全长的克隆及序列分析

5．2．3 甘蔗抗寒相关基因在低温胁迫下的表达分析

5．3 讨论

5．3．1 SoPOD1基因在甘蔗低温胁迫中的作用

5．3．2 So20S基因在甘蔗低温胁迫中的作用

5．3．3 SoTUA基因在甘蔗低温胁迫中的作用

5．3．4 SoCBL基因在耐甘蔗低温胁迫中的作用

5．4 小结

6 结论

6．1 全文总结

6．2 论文创新点

6．3 问题与展望

致谢

论文说明

参考文献

附录 作者在攻读博士学位期间科研、学术活动和论文发表情况