活疫苗污染外源性ALV的检测及泛素介导的ALV-J多基因共表达DNA疫苗的构建

摘要

禽白血病(Avian leukosis，AL)由反转录病毒科、α反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起，其中J亚群ALV是目前最为普遍、对养殖业危害最为严重的亚群。目前对其防控最为有效的手段是对种鸡群进行净化。为了更好的服务于疫病的净化与防控工作，本课题一方面对部分开展净化工作的种鸡场常用的活疫苗进行外源性ALV的检测，另一方面进行了泛素介导的基于ALV-J多基因串联共表达DNA疫苗的构建。主要内容如下:
　　首先，课题对广西、广东开展ALV净化的4家种鸡场常用的由14家疫苗公司生产的11种类型共计45份的活疫苗进行外源性ALV的检测。采用的方法包括疫苗直接进行PCR的检测以及将疫苗接种DF1细胞进行病毒分离培养。结果在2份活疫苗中检测到了ALV-J，经过病毒全基因组序列的测定与分析，发现二株病毒的核苷酸同源性为97.5％，与参考毒株的同源性比较发现，2个疫苗毒株与2009年在中国江苏病鸡中分离的JS09GY3株的亲缘关系最近且核苷酸同源性均为95.5％。
　　其次，课题通过PCR方法分别扩增泛素基因与ALV-J HG03毒株的gp85、P27和P10基因，通过各基因之间的酶切位点进行连接，将串联的片段连接到真核表达载体pVAX1上，成功构建了5个重组质粒即pVAX1-Ub1-gp85、pVAX1-Ub1-gp85-P27、pVAX1-Ub1-gp85-P10、pVAX1-Ub1-gp85-P27-P10和pVAX1-Ub2-P27-P10，然后分别将重组质粒转染DF1细胞，在转染后的12、24、48、72小时，应用gp85的特异性单克隆抗体及鸡抗ALV-A/B、ALV-J亚型阳性血清分别进行间接免疫荧光试验(IFA)以检测目的基因的表达情况。结果显示，构建的携带病毒蛋白的重组质粒均成功在DF1细胞中得到了表达。
　　本课题研究的结果证明，在目前使用的商品活疫苗中检测到了外源性J亚群ALV的污染;成功构建了泛素介导的基于ALV-J多基因共表达的DNA疫苗并在体外培养的细胞上得到了表达。

目录

声明

摘要

缩写、符号说明

第一章 文献综述

1．1 禽白血病及其防控的概述

1．1．1 病原学

1．1．2 流行病学

1．1．3 诊断方法

1．1．4 禽白血病的防控技术

1．2 商品疫苗中外源性ALV的污染及检测

1．3 核酸疫苗及其应用

1．3．1 核酸疫苗的免疫机理

1．3．2 核酸疫苗的佐剂

1．3．3 核酸疫苗的优点及存在的问题

1．3．4 核酸疫苗的免疫方法及途径

1．4．1 泛素-蛋白酶体系

1．4．2 泛素在增强免疫应答方面的作用

1．5 本课题研究目的与意义

第二章 种鸡场使用的部分商品活疫苗中ALV的检测、分离鉴定及全基因序列分析

2．1 材料

2．1．1 疫苗来源

2．1．2 主要试剂与细胞

2．2 方法

2．2．1 疫苗前处理

2．2．2 直接PCR检测

2．2．3 细胞培养病毒分离的检测

2．2．4 病毒分离株全基因序列测定

2．3 结果

2．3．1 疫苗直接PCR结果

2．3．2 细胞培养病毒分离后的检测结果

2．3．3 疫苗直接PCR与病毒分离后PCR的结果比较

2．3．4 分离株A1、D2全基因序列分析

2．4 小结与讨论

2．4．1 活疫苗中检测出ALV-J

2．4．2 待检疫苗的预处理

2．4．3 疫苗中分离毒株基因序列分析

2．4．4 使用污染外源性ALV的疫苗对净化的影响

2．4．5 活疫苗中外源性ALV作为传播途径的可能性

2．4．6 疫苗直接PCR与病毒分离后PCR结果的分析

第三章 泛素介导的ALV-J多基因串联表达DNA疫苗的构建

3．1 材料

3．1．1 毒株、菌株、细胞、质粒及单克隆抗体

3．1．2 载体

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 常用试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 目的基因的扩增

3．2．3 重组克隆载体的构建及鉴定

3．2．4 真核表达载体的构建及鉴定

3．2．5 重组质粒转染DF1细胞

3．2．6 间接免疫荧光试验检测目的蛋白表达

3．3 结果

3．3．1 目的基因的扩增

3．3．2 重组克隆载体的构建与鉴定

3．3．3 真核表达载体的构建及鉴定

3．3．4 间接免疫荧光试验检测目的蛋白的表达

3．4 小结与讨论

3．4．1 重组质粒的成功构建

3．4．2 泛素介导的ALV-J多基因共表达DNA疫苗的应用前景

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历

攻读硕士学位期间参与的科研项目及论文发表情况