抗新城疫病毒单链抗体(scFv)载体构建及表达研究

摘要

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一类禽类呼吸道疾病，感染宿主高度致死，因此对中国乃至全球的家禽业造成巨大的威胁，至今仍无特异性治疗药物。单链抗体(scFv)是免疫球蛋白最小的功能性结构单元，具有抗原结合活性，且在脊椎动物与非脊椎动物中均能表达。单链抗体除了应用于医学诊断与治疗，还具有中和病毒的能力。本研究探索利用PiggyBac转座子系统构建抗新城疫病毒单链抗体真核表达载体，分别为pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv、pB315B-EF1α-puro-pGFP-scFv。通过脂质体LipofectamineTM2000将构建的两个重组质粒分别转染DF-1细胞和293T细胞，获得了稳定转染抗新城疫病毒单链抗体的DF-1-CAG-scFv、293T-CAG-scFv、DF-1-EF1α-scFv与293T-EF1α-scFv等4种细胞系。PiggyBac转座子系统在DF-1和293T细胞中的转座效率分别为19.1％和25.8％。RT-PCR结果表明，抗新城疫病毒单链抗体基因在4种细胞中均检测到mRNA。通过western blot检测与抗新城疫病毒单链抗体融合的His标签蛋白来确定其在各细胞系中的表达情况，结果表明，在上述4种转染细胞的裂解液中均没有检测到His标签蛋白，然而在DF-1-EF1α-scFv和DF-1-CAG-scFv细胞上清中有scFv表达，前者含量高于后者。利用6倍、60倍、600倍TCID50的新城疫病毒分别感染DF-1、DF-1-CAG-scFv和DF-1-EF1α-scFv细胞。结果表明，当新城疫病毒量为60TCID50与600TCID50时，DF-1与DF-1-CAG-scFv细胞发生病变的孔数明显多于DF-1-EF1α-scFv。本实验表明，EF1α启动子对单链抗体的表达翻译效果更好，利用该启动子构建的新城疫病毒单链抗体能够在DF-1细胞中稳定表达，并分泌到细胞外，具有良好的抗新城疫病毒效果。将以EF1α为启动子的抗新城疫病毒单链抗体质粒转染鸡原始生殖细胞(PGCs)，24h后的转染效率为2.9％，经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的PGCs细胞系。本研究为抗新城疫病毒单链抗体的转基因鸡的生产奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 新城疫病毒(NDV)研究进展

1．1．1 新城疫

1．1．2 新城疫病毒简介

1．1．3 新城疫病毒结构及功能

1．1．4 新城疫病毒的复制

1．2 单链抗体研究进展

1．2．1 单链抗体结构特点

1．2．2 单链抗体的制备

1．2．3 单链抗体的表达系统

1．2．4 单链抗体的纯化

1．2．5 单链抗体的应用

1．3 转基因鸡的生产

1．3．1 转基因动物及其应用

1．3．3 转基因鸡在蛋白生产中的应用——鸡输卵管生物反应器

1．3．4 PGC介导的转基因鸡的生产

1．3．5 以PiggyBac转座子为载体的转基因鸡的生产

1．5 实验目的和意义

第二章 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的DF-1细胞系的建立

2．1 材料

2．1．1 主要设备

2．1．2 试剂、菌种、质粒

2．1．3 主要试剂配制

2．2 相关分子实验基本方法

2．2．1 PCR扩增反应

2．2．2 制粒提取

2．2．3 酶切方法

2．2．4 连接反应

2．2．5 E.coli感受态细胞制备

2．2．6 连接产物的转化

2．3 贴壁细胞培养基本操作

2．3．1 细胞复苏

2．3．2 细胞传代

2．3．3 细胞冻存

2．4 实验方法

2．4．1 抗新城疫病毒单链抗体质粒的构建

2．4．2 pB31 5B—EF1 α-puro—GFP-ScFv质粒构建

2．4．3 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体(scFv)细胞系的建立

2．5 实验结果

2．5．1 scFv基因的克隆及重组质粒的鉴定

2．5．2 pB513B—EF1α—puro—pGFP—scFv质粒构建

2．5．3 筛选稳定转染DF-1细胞的最佳嘌呤霉素浓度确定

2．5．4 PiggyBac转座子系统在不同细胞的转染效率

2．5．5 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体细胞系的建立

2．6 讨论

2．7 小结

第三章 抗新城疫病毒单链抗体在细胞中表达的检测及功能研究

3．1 实验材料

3．1．1 仪器

3．1．2 实验试剂与细胞

3．1．3 细胞

3．2 主要试剂的配制

3．3 实验方法

3．3．1 RT-PCR检测抗新城病毒单链抗体在细胞中的转录水平

3．3．2 蛋白检测抗新城疫抗体在细胞中的表达量

3．3．3 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体DF-1细胞抗新城疫病毒活性检测

3．4 结果

3．4．1 抗新城病毒单链抗体基因在细胞中的mRNA水平检测

3．4．2 抗新城疫病毒单链抗体在细胞中的蛋白表达

3．5 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体细胞对新城疫病毒的抗性检测

3．5．1 DF-1细胞感染新城疫病毒的TCID50检测

3．5．2 DF-1-CAG-seFv与DF-1-EF1α-scFv细脆抗新城疫病毒能力检测

3．6 讨论

3．7 小结

第四章 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的鸡原始生殖细胞(PGC)系的建立

4．1 实验材料

4．1．1 仪器

4．1．2 实验试剂

4．1．3 细胞

4．1．4 主要溶液配置

4．2 实验方法

4．2．1 嘌呤霉素对PGC最低致死浓度确定

4．2．2 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的PGC细胞系的建立

4．3 实验结果

4．3．1 嘌呤霉素对PGC细胞的最低致死浓度

4．3．2 稳定表达抗新城疫病毒单链抗体PGC细胞系的建立

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

缩略词表

致谢

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