南宁某牛场奶牛乳房炎调查及其快速检测方法的建立与应用

摘要

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是奶牛主要的常见疾病之一，大幅减产的奶产量和低劣的乳品质引发一些公共卫生学问题，故该疾病对于奶农及乳品加工行业来说是一个沉重的经济负担，其防控措施对该行业的可持续发展则显得尤为重要。本研究选取南宁某牛场定期采集奶样对乳房炎进行动态监测，调查其发病状况;同时收集临床样本分离和鉴定主要病原菌及药物敏感性试验;选取金黄色葡萄球菌nuc基因、链球菌属的保守序列延伸因子Tu基因、大肠杆菌的B基因保守序列，建立其快速检测法（可视化LAMP法）;具体研究如下:
　　试验一:南宁某奶牛场乳房炎的动态监测
　　2015年3月至10月于广西南宁某牛场每月定期随机采集奶牛个体奶样50份和3份大缸混合奶样，分别采用体细胞计数法、加州乳房炎检测法CMT及奶牛隐性乳房炎检测试纸条法。结果表明:CMT法与体细胞计数法的结果基本相符，虽然CMT法是传统的经典方法，但其只能对结果进行大概的估计且存在误差，而试纸条则不能很好的反应检测结果，故牛场在平时的乳房炎防控监测上最好采用体细胞计数法。
　　试验二:奶牛乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏试验
　　为了解乳房炎主要致病菌金黄色菌葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的耐药性，随机采集乳样228份进行体细胞数检测，筛选出75份进行细菌的分离鉴定及药敏试验，其中检出167株可疑菌株，并通过生化鉴定等确定出金黄色葡萄球菌28株，占16.8％，乳链球菌10株、停乳链球菌4株、乳房链球菌2株，占9.6％，大肠杆菌35株，占21.0％。分离的金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌的耐药率分别为:25.9％、35.3％、38.3％，其中大肠杆菌分离株对链霉素等已经100％耐药，而对恩诺沙星也出现了耐药性;金黄色葡萄球菌对氨苄西林等已经100％耐药，对恩诺沙星、红霉素也有较高的耐药性，而对乙酰罗红霉素、多西环素部分已经耐药;链球菌对阿米卡星等已经100％耐药，其中三类菌对庆大霉素、头孢唑啉等都具有较高敏感性。
　　试验三:可视化LAMP检测方法的建立与应用
　　针对金黄色葡萄球菌nuc基因、链球菌属的保守序列延伸因子Tu基因、大肠杆菌的B基因保守序列基因，通过在线软件Primer ExplorerV4进行引物设计。就内外引物浓度比进行了优化，从而建立由三种主要致病菌导致的奶牛乳房炎可视化LAMP检测方法，并对66份临床奶样进行检测。结果表明:三者的25μL LAMP可视化方法的反应体系的配液量基本相同，反应条件也大致相同，仅内外引物浓度比略有差异，故检测中可事先将反应液配置好同时进行。结果简单明了，无需具备较高的专业素质。此外，该方法特异性较好且对链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌DNA的检出限依次为56.0 fg/μL，46.5 fg/μL，8.00fg/μL。分别用水煮法、微波法与试剂盒法提取人工污染样品所获得的DNA模板都可得到检测结果，而从时间经济成本上看微波法是最佳的选择。通过配液时提前添加钙黄绿素及含螯合剂Mn2+的氯化锰溶液，以达到肉眼观察的效果，既能避免产生气溶胶，也可减少和避免假阳性结果的发生。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

1．1 奶牛乳房炎概况及公共卫生学意义

1．1．1 奶牛乳房炎概况

1．1．2 公共卫生学意义

1．2 奶牛乳房炎病原学研究

1．2．1 主要病原菌生物学特性

1．2．2 主要病原菌致病基因和特异性基因

1．2．3 病原菌耐药性

1．2．4 主要病原菌生物膜及危害

1．2．5 检测技术的研究进展

1．3 LAMP检测技术

1．3．1 LAMP检测技术的原理

1．3．2 LAMP检测技术的优点

1．4 本研究的目的和意义

第二章 南宁某奶牛场乳房炎的动态监测

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 样品采集

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 加州乳房炎检测CMT法

2．2 奶牛隐性乳房炎检测试纸条法

2．3 体细胞计数法

3 试验结果与分析

3．1 加州乳房炎检测CMT法

3．2 奶牛隐性乳房炎检测试纸条法

3．3 体细胞计数法

3 分析与讨论

3．1 三种检测方法的效果比较

3．2 体细胞数(SCC)与科学养殖

第三章 奶牛乳房炎主要病原菌分离鉴定及药敏试验

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 样品

2．试验方法

2．1 细菌的增菌

2．2 细菌的分离

2．3 细菌的纯化

2．4 触酶试验

2．5 血浆凝固酶试验

2．6 CAMP试验

2．7 生化鉴定试验

2．8 药敏试验

3．试验结果

3．1 培养特性及镜检结果

3．2 生化试验结果

3．3 药敏试验结果

4 讨论与分析

第四章 可视化LAMP检测方法的建立与应用

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 样品(细菌基因组模板)

2 方法

2．1 LAMP引物设计与筛选

2．2 LAMP外引物PCR验证

2．3 常规LAMP反应体系及主要操作

2．4 LAMP检测反应体系优化

2．5 可视化LAMP检测法的建立

2．6 LAMP检测方法的特异性试验

2．7 LAMP对试验二中分离鉴定的菌株进行检测

2．8 LAMP检测方法的敏感性试验

2．9 人工模拟污染牛奶中3种病原菌的LAMP检测试验

2．10 等温扩增(LAMP)方法检测三种乳房炎病原菌临床分离株试验

3 试验结果与分析

3．1 LAMP引物设计与筛选

3．2 LAMP外引物PCR验证

3．3 LAMP检测反应体系优化

3．4 可视化LAMP检测法的建立

3．5 特异性试验

3．6 敏感性试验

3．7 三种病原菌人工污染牛奶检测试验

3．8 可视化LAMP诊断应用

4 讨论

4．1 乳房炎三种主要病原菌LAMP方法建立的思考

全文结论

参考文献

致谢

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