内生固氮菌DX120E与甘蔗互作的生理和分子生物学基础研究

摘要

甘蔗是重要的糖料和能源作物，生长周期长，需肥量大，尤其是氮肥。广西是甘蔗种植大省，蔗糖年产量约占全国的70％。然而广西的甘蔗种植地区大量施用氮肥，不仅成本高而且还会造成环境污染。因此，我们需要寻找一种能够减少氮肥施用的有效途径，生物固氮则是最佳的选择。目前，已有研究人员从广西主栽甘蔗品种中分离和鉴定到一批固氮菌并对部分几个固氮菌做了初步的接种试验。然而，至今尚未发现有对联合固氮菌与甘蔗互作开展比较系统研究的报道。本研究通过对从广西主栽甘蔗品种新台糖22号中分离鉴定的一株固氮菌DX120E进行了全基因组测序，并用该固氮菌接种两个不同甘蔗品种后比较该固氮菌对甘蔗生长生理特性的影响，比较了该固氮菌与固氮模式菌株PAL5的固氮能力，同时还进行了固氮菌DX120E与甘蔗组培苗互作的蛋白质组学研究，旨在探讨固氮菌DX120E促进甘蔗生长和固氮的生理和分子机制。主要研究结果如下:
　　1.固氮菌DX120E在2个甘蔗品种（B8和GT21）的根、叶鞘和叶内均能定殖，定殖的细菌量依次为根＞叶鞘＞叶。DX120E可以从甘蔗根表面的裂隙、主根和侧根发生处及根的断裂处入侵，主要在根表面细胞间隙和细胞内大量定殖，同时也可迁移到叶片的叶肉细胞和维管束细胞中定殖;不同接种浓度下，最大定殖数量无显著差异，1×102 CFU mL-1的接种量足够侵入甘蔗并积累定殖。
　　2.接种固氮菌DX120E可以有效促进甘蔗植株生长和对矿质营养的吸收，显著提高甘蔗植株体内的硝酸还原酶(NR)活性，同时也能在一定程度上提高植株体内谷氨酰胺合成酶(GS)活性，增加硝态氮含量，接种固氮菌DX120E还能显著提高两个甘蔗品种叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)。固氮菌DX120E与固氮模式菌株PAL5比较接种试验表明两种固氮菌均具有固氮能力，并且固氮菌DX120E表现出具有比固氮菌PAL5更高的固氮效率。
　　3.根据16S rRNA、rpoB和gyrA三个基因的克隆和测序和系统进化树的分析结果，固氮菌DX120E归属为变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。全基因组测序的结果显示DX120E基因组包含一条环状染色体和两个质粒。其中包含了5，718，434个核苷酸，GC含量57.1％，5172个蛋白质编码基因，25个rRNA基因，87个tRNA基因，25个假基因和2个成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)。GOC数据库对菌株DX120E基因组进行功能注释的结果显示在已知的基因功能分类中，糖类转运与代谢、氨基酸转运与代谢和转录这三个功能所占的比例最高，分别占预测总蛋白总数的11.3％、10.4％和9.5％。
　　4.利用双向电泳技术，共找到固氮菌DX120E与甘蔗组培苗在1/10 MS液体培养基共培养48 h后固氮菌的差异表达蛋白共22个，质谱鉴定成功18个，其中有8个上调表达，10个下调表达。鉴定到的差异蛋白质主要参与了能量、代谢（氨基酸代谢和碳水化合物代谢）、防卫反应和细胞转运这4种功能，各类功能蛋白分别占总差异蛋白质的38.9％、27.8％、22.2％和11.1％。利用ITRAQ结合质谱分析的蛋白质组学技术，共获得与固氮菌DX120E共培养48 h后甘蔗组培苗根以上部分的差异表达蛋白246个，其中上调表达240个（已知蛋白109个），下调表达6个（已知蛋白4个）。这些已知差异表达蛋白根据蛋白质的分子功能主要分成11类，其中参与防卫反应占23.9％，参与代谢反应占16.5％，参与蛋白质转化（包括蛋白质合成、折叠加工以及蛋白质水解）占12.8％，参与能量代谢以及光合作用的均占10.1％，参与细胞内转运的占6.4％，转录相关的蛋白占5.5％，信号转导相关的蛋白占4.6％，细胞结构相关的蛋白和未知分类蛋白，均占3.7％。比例最少的是细胞生长和分化，占2.8％。

目录

声明

摘要

缩写表

1 前言

1．1 甘蔗联合固氮菌的分离鉴定

1．2 联合固氮菌在甘蔗体内的定殖

1．3 联合固氮菌对甘蔗的促生作用

1．4 联合固氮菌对甘蔗生长生理的影响

1．5 甘蔗基因型和环境因子对甘蔗联合固氮的影响

1．6 甘蔗联合固氮的分子机理

1．6．1 固氮酶的结构和基因

1．6．2 固氮酶基因的检测

1．6．3 甘蔗与联合固氮菌互作的基因组学和蛋白质组学研究

1．7 研究的目的和意义

1．8 研究的技术路线

2 固氮菌DX120E在甘蔗植株内的定殖

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 甘蔗组培苗的培养

2．1．3 无菌条件下固氮菌DX120E的接种

2．1．4 荧光显微镜检测GFP标记的DX120E在甘蔗植株内的定殖

2．1．5 内生固氮菌DX120E重分离培养的平板实验

2．2 结果和分析

2．2．1 DX120E在甘蔗组培苗根和叶中的定殖

2．2．2 不同接菌水平下固氮菌DX120E在培养基中群体密度

2．2．3 不同接菌水平下DX120E在甘蔗组培苗植株内的群体数量

2．2．4 同一接菌水平下DX120E在甘蔗组培苗不同器官内的的群体动态

2．3 讨论

3 固氮菌DX120E接种甘蔗后对甘蔗生长生理的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 盆栽试验设计

3．1．3 DX120E在甘蔗体内定殖量的检测

3．1．4 株高的测定

3．1．5 叶片叶绿素含量、氮代谢相关酶活性和硝态氮含量的测定

3．1．6 生物量和矿质元素含量的测定

3．1．7 光合生理参数的测定

3．1．8 接种处理后的甘蔗组培苗不同部位固氮基因nifH的扩增

3．1．9 数据处理

3．2 结果和分析

3．2．1 固氮菌DX120E在甘蔗植株体内的定殖数量

3．2．2 接种固氮菌DX120E对甘蔗株高的影响

3．2．3 接种固氮菌DX120E对甘蔗叶片叶绿素、硝态氮含量和氮代谢相关酶活性的影响

3．2．4 接种固氮菌DX120E对甘蔗植株生物量的影响

3．2．5 接种固氮菌DX120E对甘蔗植株矿质元素含量的影响

3．2．6 接种固氮菌DX120E对甘蔗植株矿质元素积累量的影响

3．2．7 接种固氮菌DX120E对甘蔗光合生理的影响

3．2．8 接种后两个甘蔗品种组培苗不同部位nifH基因片段扩增结果

3．3 讨论

4 广西本地分离的内生固氮菌Klebsiella sp．DX120E与巴西分离的内生固氮模式菌株Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5的比较研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 盆栽试验设计

4．1．3 株高的测定

4．1．4 生物量的测定

4．1．5 N含量和15N原子百分超的测定

4．1．6 光合生理参数的测定

4．1．7 数据处理

4．2 结果与分析

4．2．1 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种株高的影响

4．2．2 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种苗期生物量的影响

4．2．3 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种苗期氮含量的影响

4．2．4 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种苗期15N原子百分超、固氮百分率和固氮量的影响

4．2．5 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种伸长期生物量的影响

4．2．6 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种伸长期氮含量的影响

4．2．4 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种伸长期15N原子百分超、固氮百分率和固氮量的影响

4．2．5 接种固氮菌DX120E和PAL5对两个甘蔗品种伸长期光合生理参数的影响

4．3 讨论

5 内生固氮菌DX120E的鉴定和全基因组测序

5．1 材料和方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试剂和仪器

5．1．3 细菌DNA的提取

5．1．4 细菌单菌落裂解液的制备

5．1．5 16S rRNA、rpoB和gyrA基因的克隆和测序

5．1．6 系统进化树的构建

5．1．7 基因组测序

5．1．8 基因预测及注释

5．2 结果和分析

5．2．1 16S rRNA、rpoB和gyrA基因的PCR扩增结果

5．1．2 16S rRNA、rpoB和gyrA基因的系统进化树分析

5．2．3 DX120E基因组的组装

5．2．4 DX120E基因组的概况

5．2．5 基因组的COG功能分类

5．3 讨论

6 固氮菌DX120E与甘蔗组培苗互作的蛋白质组学研究

6．1 材料与方法

6．1．1 植物材料和菌种

6．1．2 材料处理和取样

6．1．3 主要仪器设备和生化试剂

6．1．4 细菌总蛋白的双向凝胶电泳

6．1．5 甘蔗组培苗接种固氮菌DX120E后的蛋白质组分析

6．2 结果与分析

6．2．1 固氮菌DX120E菌体总蛋白的SDS-PAGE

6．2．2 固氮菌DX120E菌体总蛋白的双向电泳条件的筛选

6．2．3 固氮菌DX120E的菌体总蛋白与甘蔗组培苗共培养后的双向电泳分析

6．2．4 固氮菌DX120E与甘蔗组培苗共培养后的差异蛋白点的质谱鉴定

6．2．5 鉴定的固氮菌DX120E的差异表达蛋白质的功能分类

6．2．6 与固氮菌DX120E共培养后的甘蔗组培苗根以上部分的蛋白组鉴定结果

6．2．7 甘蔗组培苗与固氮菌DX120E共培养后根以上部分差异表达蛋白功能分类

6．3 讨论

6．3．1 甘蔗组培苗对固氮菌DX120E蛋白质的影响

6．3．2 固氮菌DX120E对甘蔗组培苗根以上部分蛋白质的影响

7 结论

7．1 全文总结

7．2 本论文的创新点

7．3 问题与展望

致谢

参考文献

附录