基于降氰过程成本控制的产碱杆菌DN25发酵培养基优化

摘要

由实验室筛选保藏的产碱杆菌Alcaligenes sp.DN25具有较高的降氰活性，有一定的工业应用价值。处理成本是工艺能否工业化的考量指标之一，而培养基的成本在细胞培养环节中占据重要作用。本论文从成本控制的角度出发，对产碱杆菌DN25发酵培养基进行优化，并构建实时定量PCR方法研究氨基酸对降氰酶基因表达水平的影响，从而为未来产碱杆菌DN25的工业应用提供一些基础数据。
　　建立实时定量PCR方法检测产碱杆菌DN25降氰基因的表达水平，能免除国标法测定氰化物所造成的轻度污染。分别制各目的基因cdE和内参基因16S rRNA标准品，梯度稀释后制作标准曲线，得到R2分别为0.9985和0.9991，扩增效率分别为1.04和0.97。
　　选取价格低廉、来源广泛的农林废料取代葡萄糖、酵母粉和蛋白胨作为培养基的碳氮源，并考察其最适加入量;研究金属离子对产碱杆菌DN25生长和活力的影响。优化后培养基成分(g/l):玉米浆10 g，NH4Cl5 g，NaCl0.5 g，K2HP042 g，pH=8.0。相比于基本培养基，优化后生物量和菌体活力分别提高了29.0％和29.3％，成本降低了66.5％，同时培养时间缩短，到达稳定期的时间减少了4h，生长速率提高了2.1倍。
　　考察甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸对产碱杆菌DN25生长和活力的影响情况，发现不同氨基酸的影响作用不同。只有苯丙氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、组氨酸和半胱氨酸能够促进菌体的生长，生物量分别提高了5.5、4.6、3.2、2.0和1.3倍。菌体活力结果表明，组氨酸和丙氨酸与对照组的相差不大，而半胱氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸的菌体活力有所降低，分别减少了63％、61％和82％。实时定量PCR方法检测得到的降氰酶基因表达量与其活力大致吻合，证明该法检测产碱杆菌DN25降氰基因表达水平的适用性，可为未来控制培养成本的研究提供一些实验手段。
　　本文利用新型玉米浆培养基作为产碱杆菌DN25的营养源，提高了生物量和活力，并且降低了成本。实时定量PCR方法表明，氨基酸对产碱杆菌DN25的生长有促进作用，但无法刺激降氰酶的分泌与表达。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 生物法处理含氰废水的概述

1．1．1 氰化物的来源

1．1．2 生物法处理含氰废水的研究现状

1．2 生物法处理的技术经济分析

1．2．1 低成本培养基的设计与优化

1．2．2 氨基酸对微生物生长和活性的影响

1．3 课题研究的目的及意义

1．4 本文主要研究内容

第二章 用于检测产碱杆菌DN25降氰基因表达水平的RT-PCR方法的建立

2．1 实验材料与设备

2．1．1 实验试剂

2．1．2 菌株和培养基

2．1．3 实验仪器及型号

2．2 实验方法

2．2．1 菌体培养

2．2．2 细胞RNA的提取及浓度测定

2．2．3 细胞RNA的逆转录

2．2．4 引物的设计与合成

2．2．5 cdE和16S rRNA质粒标准品的制备

2．2．6 实时定量PCR体系的建立

2．2．7 数据处理与统计分析

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 总RNA电泳图

2．3．2 cdE和16S rRNA引物退火温度的选择

2．3．3 引物特异性的结果分析

2．3．4 标准品的制备

2．3．5 扩增曲线的分析

2．3．6 标准曲线的分析

2．3．7 熔解曲线的分析

2．4 本章小结

第三章 产碱杆菌DN25培养基成本的优化

3．1 实验材料与设备

3．1．1 实验试剂

3．1．2 菌株及培养基

3．1．3 实验仪器及型号

3．1．4 基本培养基的成本计算

3．2 实验方法

3．2．1 菌体培养

3．2．2 碳源的选择及其添加量的优化

3．2．3 氮源的选择及其添加量的优化

3．2．4 不同金属离子的影响

3．2．5 优化前后培养基的生长曲线及相对表达水平的测定

3．2．6 分析方法

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 氰离子浓度标准曲线

3．3．2 菌株降解氰化物初速度时间的确定

3．3．3 OD600与细菌菌落总数CFU的关系曲线

3．3．4 碳源对DN25生长、活力及成本的影响

3．3．5 不同浓度的玉米浆对DN25生长、活力及成本的影响

3．3．6 氦源对DN25生长、活力及成本的影响

3．3．7 不同浓度的NH4Cl对DN25生长、活力及成本的影响

3．3．8 金属离子对DN25生长与活力的影响

3．3．9 菌株的生长曲线及相对表达水平分析

3．4 本章小结

第四章 氨基酸对产碱杆菌DN25生长和活力的影响

4．1 实验材料与设备

4．1．1 实验试剂

4．1．2 菌株及培养基

4．1．3 实验仪器及型号

4．2 实验方法

4．2．1 菌体培养

4．2．2 产碱杆菌DN25生长曲线的绘制

4．2．3 氢基酸对产碱杆菌DN25生长的影响

4．2．4 氨基酸对产碱杆菌DN25活力的影响

4．2．5 实时定量PCR检测降氰酶基因的表达量

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 产碱杆菌DN25在氨基酸培养基的生长曲线

4．3．3 不同氨基酸对DN25生长的影响

4．3．4 不同氨基酸对DN25活力的影响

4．3．5 不同氨基酸对DN25降氰酶基因表达的影响

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢