Nanos2基因在水牛精原干细胞中的特异性表达的研究

摘要

水牛精原干细胞(SSCs)是一种既能够进行自我更新，又可以进行减数分裂产生携带有遗传物质的单倍体配子的细胞，在水牛生殖生理过程中发挥着至关重要的作用。研究水牛精原干细胞将有望解决水牛繁殖力低下的问题，也更有利于我们对水牛精子发生过程进行深入研究，并能够利用精原干细胞生产转基因动物等。研究精原干细胞的过程中，寻找到一种可作为水牛精原干细胞特异性标记的基因是我们得以开展后续实验的基础。Nanos2隶属于于Nanos基因家族，是一种重要的RNA绑定蛋白基因，在小鼠上能够调节和控制雄性生殖系干细胞的发育和自我更新，在水牛上对该基因尚无相关研究。本课题期望通过对研究Nanos2基因在水牛精原干细胞中的表达，确定一种水牛精原干细胞的特异性标记基因，并以此基因为基础，进行相关调节及信号通路的深入研究。
　　第一章:使用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得水牛Nanos2序列全长，随后通过生物信息学分析，发现水牛Nanos2与其他常见哺乳动物物种之间呈现较高的保守性。
　　第二章:利用qRT-PCR技术检测水牛Nanos2的mRNA表达水平，发现虽然Nanos2在水牛的多个组织中表达，但在睾丸组织中发现其mRNA表达水平最高，并且随着年龄增长，Nanos2的mRNA表达水平在胎儿和青春期的水牛睾丸组织中较高，在成年睾丸中显著降低。经过细胞分选，并对分选出的精原干细胞进行qRT-PCR检测，发现在精原干细胞中的Nanos2的mRNA表达水平显著高于睾丸中其他类型的细胞。通过免疫组织化学分析，发现在青春期睾丸中NANOS2表达的模式类似于精原干细胞标记PGP9.5的模式;相反，NANOS2的表达在成年睾丸中较低，并限于细长型精子细胞。通过WesternBlot实验，检测到NANOS2蛋白大小约为37kDa。
　　第三章:探索利用免疫缺陷型裸鼠为实验载体进行水牛睾丸体外结构重组，构建体外验证精原干细胞功能性实验模型，初步论证了异种睾丸组织细胞在裸鼠背部皮下的组织重构可行性，为后续研究精原干细胞中Nanos2的相关调控机制对水牛雄性生殖生理过程的影响提供了实验平台。
　　以上研究首次证明了Nanos2是水牛早期精原干细胞的分子标记，并可能与其在小鼠中的表达模式类似，是水牛精原干细胞发育和自我更新过程中起着关键作用的调控基因。

目录

声明

摘要

第一部分 综述

第一章 精原干细胞分子标记的研究

第二章 Nanos2基因功能的研究

2．1 Nanos2基因在精子发生过程中的表达

2．2 Nanos2对精原干细胞的维持是必需的

2．3 Nanos2通过抑制分化来保持干细胞特性

第三章 体外诱导精子的研究

3．1 睾丸组织块体外培养

3．2 精原细胞移植

3．3 睾丸组织小块异种皮下移植法培养

3．4 睾丸细胞异种皮下培养及睾丸组织形态再发生

第二部分 实验研究

前言

第一章 水牛Nanos2基因的克隆及生物信息学分析

1．1 材料与方法

1．2 实验设计

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 Nanos2基因在睾丸组织中的表达状况分析

2．1 材料与方法

2．2 实验设计

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 构建水牛睾丸组织的体外重构模型

3．1 材料与方法

3．2 实验设计

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

总结论

参考文献

附表

致谢

硕士期间科研成果及获奖情况