拟南芥受十字花科黑腐病菌诱导或抑制的miRNA的鉴定

摘要

miRNA(microRNA)是存在于真核生物细胞中长度～22nt(nucleotide)的内源非编码RNA。miRNA参与生长发育、组织分化、肿瘤发生、细胞凋亡等一系列重要的生命过程。此外，miRNA在植物对抗病原菌入侵的防卫反应中起重要作用。拟南芥是研究寄主植物与病原菌互作分子机理的模式植物。目前人们已经在拟南芥中发现了多个参与对抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.Syringae，Pst)入侵的miRNA。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris，Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌，同时也可以侵染拟南芥。但是，参与对抗Xcc侵染的拟南芥miRNA至今未见报道。研究表明，在对抗病原菌入侵的防卫反应中起重要作用的miRNA的表达往往会受到病原菌的诱导或者抑制。本研究的目的是鉴定拟南芥中受Xcc诱导或者抑制的miRNA，为鉴定在对抗Xcc侵染过程中起重要作用的miRNA打下基础。
　　为此，我们首先采用高通量RNA测序(RNA-seq)技术，测定了拟南芥在没有感染以及在感染Xcc后的不同时期的miRNA表达谱，并通过差异表达分析确定受Xcc诱导或抑制的候选的miRNA;然后采用定量Northern杂交方法对这些候选miRNA进行验证。在进行高通量RNA测序前，我们首先建立了一种适合于测定拟南芥与病原菌互作过程中寄主和病原菌转录组变化的接种方法—真空抽滤法。随后，我们测定了哥伦比亚0生态型(Col-0)拟南芥在没有感染以及在感染Xcc和hrcV基因突变体(△hrcV)后2、6、12和24小时的miRNA表达谱;通过表达差异分析，确定了10个受Xcc诱导的候选miRNA。定量Northern杂交验证结果显示，miR166和miR393在接种Xcc后2小时时的达量显著升高，而miR160和miR156在接种后24小时时的表达量显著升高，说明这些miRNA的表达受Xcc诱导。此外，通过Northern杂交，我们还发现了3个新的拟南芥miRNA。
　　本研究采用RNA-Seq技术对拟南芥中受Xcc诱导或抑制的miRNA进行了系统鉴定，发现miR156、miR160、miR166和miR393受Xcc诱导。这是首次在拟南芥中发现受Xcc诱导或抑制的miRNA，为进一步研究miRNA在拟南芥—Xcc互作过程的作用的打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1．2 miRNA命名及鉴定

1．1．3 miRNA研究方法

1．2 miRNA生物合成

1．2．1 miRNA基因转录

1．2．2 剪切加工

1．2．3 形成成熟的miRNA

1．2．4 miRNA合成及功能相关的几种关键蛋白质

1．3 miRNA作用机制

1．3．1 通过翻译抑制进行调控

1．3．2 通过诱导mRNA降解进行调控

1．4 miRNA功能研究进展

1．4．1 miRNA在植物形态发生过程中起关键作用

1．4．2 miRNA在植物的非生物胁迫应答反应中有重要作用

1．5 miRNA在植物与病原物的相互作用中起重要作用

1．5．1 miRNA在抗病毒的防卫反应中有重要作用

1．5．2 miRNA在抗病原菌的防卫反应中有重要作用

1．6 十字花科黑腐病菌简介

1．7 本研究的目的和意义

2．1 材料与试剂

2．1．1 供试植物材料

2．1．2 供试菌株

2．1．3 抗生素及使用浓度

2．1．4 培养基及营养土配方

2．1．5 RNA探针及其合成模板

2．1．6 主要试剂及配置

2．1．7 相关数据库及技术支持网站

2．2 试验方法

2．2．1 拟南芥培养

2．2．2 菌悬液制备方法

2．2．3 真空抽滤方法

2．2．4 拟南芥叶子保存

2．2．5 拟南芥总RNA提取

2．2．6 探针合成方法

2．2．7 Northern blot验证

3．1 引言

3．2 技术路线

3．3 拟南芥接种方法优化

3．3．1 拟南芥培养

3．3．2 真空抽滤

3．3．3 拟南芥接种Xcc

3．4 拟南芥受Xcc诱导或抑制的候选miRNA

3．4．1 总RNA提取

3．4．2 小RNA文库的构建及测序

3．4．3 测序结果生物信息学分析

3．5 候选miRNA的验证

3．5．1 已知miRNA差异表达验证

3．5．2 新的miRNA杂交验证

3．6 本章小结及讨论

3．6．1 实验设计

3．6．2 拟南芥接种方法讨论

3．6．3 候选miRNA验证

3．6．4 验证结果分析

第四章 讨论与展望

4．2 miRNA检测方法比较

4．3 差异表达miRNA分析

4．4 展望

参考文献

致谢

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