十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应蛋白XC3176和XC1210调控植物先天免疫的研究

摘要

寄主植物在遭受植物病原菌的侵染时，能识别到病原菌所携带的病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)从而激活病原物相关分子模式免疫反应(PAMP-triggeredimmunity,PTI)。植物病原细菌通过Ⅲ型分泌系统将效应蛋白注入植物细胞，抑制植物的PTI，引起植物效应物激发的敏感性(effector-triggeredsusceptibility,ETS)。目前大多数效应蛋白与植物之间的相互作用分子机制仍然不清楚，研究效应蛋白与植物之间的相互作用将加深我们对细菌致病机理和植物免疫应答的认识。
　　十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)是一种重要的植物病原细菌，能够在全球范围内侵染十字花科植株，带来巨大的经济损失。目前在Xcc8004中已鉴定了17个Ⅲ型效应蛋白，但大部分效应蛋白与植物之间相互作用的分子机制仍不清楚。本实验拟对XC3176和XC1210这两个致病相关Ⅲ型效应蛋白调控植物的先天免疫进行研究。
　　首先通过PEG/Ca介导拟南芥原生质体瞬时表达系统，对XC3176和XC1210进行亚细胞定位，发现XC3176定位在寄主细胞的细胞质中，XC1210定位在寄主细胞的细胞膜上。然后检测了XC3176和XC1210的缺失突变体在拟南芥上的致病力，相比于野生型Xcc8004， XC3176和XC1210的缺失突变体在拟南芥上的致病力明显下降。为了进一步探究XC3176和XC1210与寄主植物之间的相互作用，本研究构建了在拟南芥中稳定表达XC3176和XC1210的转基因植系。实验发现XC3176和XC1210的稳定表达能够抑制寄主植物的胼胝质沉积，降低寄主植物PTI早期防御相关基因At1g51890、At2g17740、AtFRK1和At5g57220的表达。通过压渗接种的方法检测Xcc8004、丁香假单胞菌DC3000和△hrcV在XC3176、XC1210以及它们的对照空载体pBI121拟南芥转基因植株上的致病力,结果发现，相比于pBI121转基因植株，Xcc8004、丁香假单胞杆菌DC3000和△hrcV在XC3176和XC1210转基因植株上繁殖生长。

目录

声明

摘要

主要符号对照表

第一章 前言

1．1 研究植物抗病的重要性

1．2．1 PAMPs被寄主的PRRs识别

1．2．2 Ca2+浓度增加

1．2．3 MAPK级联反应

1．2．4 防卫基因的表达

1．2．5 活性氧生成

1．2．6 胼胝质沉积

1．3 效应蛋白激活的免疫反应-ETI

1．3．2 Ⅲ型效应蛋白

1．3．3 植物的R蛋白

1．3．4 R蛋白识别效应蛋白激活ETI

1．4 植物病原菌和寄主植物的相互作用

1．4．1 植物病原菌和寄主植物的共进化作用

1．4．2 效应蛋白与植物的相互作用

1．5 十字花科黑腐病菌

1．5．1 XC1210和XC3176

1．6 本研究的目的和意义

2．1 菌株和质粒

2．2 本实验中用到的引物

2．3 实验用到的培养基

2．4 实验所用抗生素、溶液与缓冲液

2．5 菌株的培养与保藏条件

2．6 总DNA和质粒的提取

2．6．1 细菌基因组DNA提取

2．6．2 拟南芥基因组DNA提取

2．6．3 质粒的小量提取

2．6．4 质粒的大量提取

2．6．5 质粒的浓缩

2．7 PCR扩增

2．7．1 引物的设计

2．7．2 PCR扩增的体系和程序

2．8 琼脂糖凝胶电泳

2．9 DNA的纯化、回收、酶切和连接

2．9．1 DNA的纯化和回收

2．9．2 DNA酶切

2．9．3 DNA的连接

2．10 感受态细胞的制备、电脉冲转化及转化子的验证

2．10．1 感受态细胞的制备

2．10．2 电脉冲转化

2．10．3 转化子的验证

2．11 三亲本接合及接合子的验证

2．12 拟南芥转基因

2．12．1 拟南芥的生长

2．12．2 拟南芥的转化

2．12．3 转基因拟南芥的验证

2．13 qRT-PCR

2．13．1 拟南芥RNA的提取

2．13．2 反转录反应

2．12．3 qRT-PCR

2．14 胼胝质沉积

2．15 拟南芥原生质体制备、PEG／Ca介导瞬时表达及亚细胞定位

2．16 拟南芥上致病力的检测

第三章 结果与分析

3．1 效应蛋白亚细胞定位的构建及定位

3．1．1 亚细胞定位的构建策略

3．1．2 XC3176和XC1210外源片段的扩增

3．1．3 将XC3176和XC1210克隆到pA7-YFP

3．1．4 拟南芥原生质体的制备

3．1．5 XC3176和XC1210的亚细胞定位

3．2 拟南芥转基因植株的构建

3．2．1 拟南芥转基因植株所需菌株的构建

3．2．2 载体pBI121

3．2．3 T1代拟南芥转基因植株的筛选

3．2．4 T2代拟南芥转基因植株的筛选

3．2．5 T3代拟南芥转基因植株的筛选

3．2．6 XC3176和XC1210在转基因植株中正常表达

3．3 Δ3176和Δ1210在野生型拟南芥中致病力减弱

3．4 XC3176和XC1210抑制flg22激发的PTI反应

3．4．1 XC3176抑制flg22所激活的胼胝质沉积

3．4．2 XC3176抑制PTI相关早期基因的表达

3．4．3 XC3176转基因植株中的致病性检测

3．4．4 XC1210抑制flg22所激活的胼胝质沉积

3．4．5 XC1210抑制PTI相关早期基因的表达

3．4．6 XC1210转基因植株中的致病性检测

第四章 总结与讨论

4．2 XC3176和XC1210的突变体在Arabidopsis上的致病力相对于野生型Xcc 8004明显下降

4．3 XC3176和XC1210的表达会抑制植物的PTI反应

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况