雄海马孵化袋cDNA文库的EST分析以及海马假定蛋白酶抑制剂基因的表达与性质鉴定

摘要

对文库中发现一个WAP结构域蛋白基因进行结构与功能的分析和研究,并用原核表达的方法获得重组蛋白,以期对孵化袋内的功能蛋白获得更多的了解,并试图开发该蛋白潜在功能使其获得更大的利用.应用SMART<'TM> cDNA Library Construction技术.以雄性大海马孵化袋为原始材料,构建以真核表达载体pcDNA3为基础的孵化袋cDNA文库.通过对1975个随机克隆的序列测定和生物信息学分析,获得了951个新的基因序列,包括156个cluster和795个singleton.其中有大量的小分子结合与运输蛋白基因、先天免疫相关蛋白基因以及孵化相关酶类、胚胎发生相关蛋白转录子,这些EST的分布从一个侧面反应了孵化袋的生物功能,为孵化袋是一个雄性亲体上的类子宫器官提供了分子生物学上的佐证.孵化袋cDNA文库的成功构建以及对其中所得基因的进一步功能研究,将为海马雄性孵化行为提供更多的信息,为从分子水平找到海马雄性孵化的进化理由与选择压力提供新的思路和线索.通过对海马cDNA文库的随机测序和分析,得到一个501bp的编码一个全新的WAP结构域蛋白的全长cDNA序列.它的读码框编码167个氨基酸残基的前体蛋白,编码24个氨基酸残基的信号肽和143个氨基酸残基的成熟蛋白.BLAST结果表明,该cDNA与溪红点鲑鱼(Salvelinus fontinalis)的排卵蛋白前体具有明显的同源性,蛋白质序列同源性有57％左右.序列分析表明,该蛋白由于具有明显的WAP结构域而应该属于WAP结构域家族蛋白.WAP结构域家族蛋白是一类组织来源广泛,功能多样的大家族,在已经鉴定功能的该家族蛋白中,大多数具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性和细胞增值的调节作用,故将该蛋白命名为假定蛋白酶抑制剂(hkHPI).由Blast结果还可以看出,从海马文库中找到的WAP结构域家族蛋白新成员hkHPI除了结构域骨架氨基酸与WAP家族成员具有较高的相似性以外,其余氨基酸缺乏同源性,这一点上与该家族其他成员之间的特征相吻合,暗示hkHPI除了可能具有潜在的蛋白酶抑制剂功能外还有其他的独特的生物学功能.进一步构建了pTRX-hkHPI原核表达载体,进行了诱导表达,并摸索了重组TRX-hkHPI在大肠杆菌中的表达条件,获得了具有良好可溶性的重组蛋白.通过两步Ni<'2+>螯和层析及分子筛层析等纯化步骤得到了较高纯度的重组hkHPI成熟蛋白.对重组hkHPI的生物学性质进行了研究,发现重组hkHPI对胰蛋白酶没有明显的抑制作用.

目录

缩略语

第一章绪论

1.1相关背景知识

1.2研究策略与意义

本研究的科学意义体现在：

第二章雄海马孵化袋cDNA文库的构建及EST分析

2.1材料

2.2方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5小结

2.6结果图

第三章海马假定蛋白酶抑制剂的原核表达及性质鉴定

第一节海马假定蛋白酶抑制剂基因的序列分析

3.1.1材料和方法

3.1.2结果与分析

3.1.3讨论

3.1.4小结

第二节海马假定蛋白酶抑制剂的原核表达及重组蛋白的纯化

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3结果与分析

3.2.4讨论

3.2.5小结

第三节海马假定蛋白酶抑制剂的性质鉴定

3.3.1材料

3.3.2方法

3.3.3结果与分析

3.3.4 讨论与小结

结果图

第四章海马假定蛋白酶抑制剂的转录表达情况分析

4.1材料

4.2方法

4.3结果与讨论

4.4小结

结果图

总结与展望

参考文献

在读期间发表的论文和成果

致谢

论文原创性申明