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【6h】

骨髓间充质干细胞移植后在mdx鼠体内的分布、定向分化及其机制研究

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文摘

英文文摘

论文说明:缩写表

引言

一 DMD疾病简述

二 DMD动物模型

三 DMD可能的发病机制

1细胞膜不稳定学说

2钙离子通道学说

3炎症及补体学说

4细胞凋亡学说

四 DMD治疗方法进展

(一)药物治疗

(二)基因治疗

(三)Utrophin替代疗法

(四)细胞移植

五成肌调节因子在肌肉发生中的作用

1骨骼肌发育概述

2成肌调节因子在胚胎肌肉发生中的作用

3成肌调节因子在肌肉损伤修复中的作用

六本研究的目的

材料和方法

一实验材料

(一)实验动物

(二)实验试剂

(三)实验器材

二实验技术与方法

(一)主要溶液的配制

(二)MSCs的培养和鉴定

(三)mdx鼠移植前预处理方案

(四)MSCs移植前3H-TdR的标记及移植后在体内的分布检测

(五)MSCs移植前BrdU的标记

(六)BrdU标记的MSCs的收获与移植

(七)MSCs移植后在mdx鼠体内各器官的致瘤、致畸型观察

(八)MSCs移植后肌酸激酶(CK)的测定

(九)移植后模型鼠肌肉组织HE染色

(十)移植后腓肠肌DYS的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测

(十一)移植后腓肠肌utrophin的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测

(十二)移植后腓肠肌MyoD、myogenin的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测

(十三)移植后腓肠肌devMHC的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测

(十四)数据统计

三技术路线

实验结果

一鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养和鉴定

(一)MSCs的形态学与生长特点

(二)MSCs表面标志物的检测

二3H-TdR标记MSCs移植后在体内分布的动态变化

1 3H-TdR对MSCs增殖功能的影响

2 MSCs尾静脉移植后在mdx鼠体内的放射性分布计数

三BrdU体外标记MSCs

四 MSCs移植后对mdx鼠致瘤性观察

五 MSCs移植后mdx鼠的肌酸激酶(CK)变化

六 MSCs移植后mdx鼠的肌肉组织病理改变

七 MSCs移植后mdx鼠DYS表达的动态变化

八 MSCs移植后mdx鼠Utrophin表达的动态变化

九 MSCs移植后mdx鼠MyoD表达的动态变化

十 MSCs移植后mdx鼠Myogenin表达的动态变化

十一 MSCs移植后mdx鼠devMHC表达的动态变化

讨论

一大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)的基本生物学特性

二放疗对MSCs移植的影响

三MSCs移植后在体内的分布规律

四应用BrdU标记MSCs

五 MSCs移植后对mdx鼠的致瘤性

六 MSCs移植入mdx鼠体内后CK值的测定

七 MSCs移植入mdx鼠体内后肌肉病理变化

八 MSCs移植后mdx鼠的DYS表达变化

九 MSCs移植后mdx鼠的utrophin表达变化

十 MSCs移植后MRFs的表达及MSCs向骨骼肌细胞分化的机制探讨

十一展望

结论

参考文献

附录

致谢

原创性声明

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摘要

本实验拟在体外培养SD大鼠MSCs,应用3H-TdR标记后移植入DMD的模型鼠mdx鼠进行移植,观察MSCs移植后在体内的分布情况;应用BrdU标记MSCs检测Dystrophin和Utrophin在体内的表达量和表达时间规律,以及其表达对mdx鼠的肌酸激酶(CK)、核中心移位的影响;并检测MyoD和myogenin及骨骼肌的特异性标志物胚胎型肌凝蛋白重链(devMHC)在体内的表达量和表达时间规律,探讨MSCs移植后在体内分化为骨骼肌的可能机制,为最终应用于临床实验提供理论基础。结论:应用3H-TdR标记法可以有效地标记MSCs进行移植后的体内分布研究,并且长达4个月的追踪,早期MSCs主要分布于血流丰富的器官,以后随时间延长MSCs具有明显的归巢现象,并可受病损肌肉的微环境影响向肌肉趋化,随时间延长MSCs在肌肉中分布逐渐增加。采用差速贴壁法将MSCs有效分离后,应用BrdU标记,标记率可达98%以上,可以追踪尾静脉移植后MSCs在体内的分化过程。应用3H-TdR标记或者BrdU标记MSCs并追踪其在mdx鼠体内变化,各组织器官均未发现肿瘤发生,因而MSCs移植是安全可靠的。MSCs移植后mdx鼠有DYS表达,并且随时间延长增加,应用激光共聚焦技术表明DYS阳性肌纤维来自于移植的MSCs。Utrophin在mdx鼠肌膜表达上调,在DMD疾病中对DYS有一定的功能替代作用。MSCs移植后DYS的表达对Utrophin有抑制作用,二者存在互补关系,但Utrophin的mRNA水平却无改变。MSCs移植后追踪MyoD和Myogenin的表达变化,表明部分MyoD和Myogenin阳性细胞核来源于移植的MSCs,提示成肌调节因子可能有促进MSCs分化为骨骼肌细胞的作用。

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