植物特异性小GTP结合蛋白Rab5b在气孔保卫细胞中的功能

摘要

小GTP结合蛋白是一个很大的蛋白超家族，存在于所有的真核生物中，其功能依赖GTP的水解，是信号转导的分子开关。Rab蛋白是小G蛋白超家族中最大的一个家族，参与调节细胞内各个细胞器及内膜系统的运输。Rab5亚类蛋白在动物细胞中的功能是调节内吞小泡的形成、靶向运输和融合，是调节内吞速率的关键因子。在植物中，也发现Rab5蛋白与内吞和胞内小泡运输的调节相关，但Rab5b蛋白在保卫细胞中的功能尚未阐明。 本论文对水稻OsRab5b及烟草NtRab5b在烟草气孔保卫细胞中的功能进行了初步研究，并在构建植物表达载体时发现植物表达基因一农杆菌章鱼碱合成酶ocs基因的终止子在原核生物中具有启动子活性。本研究取得以下结果： 为了获得OsRab5b蛋白的多克隆抗体，在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-OsRab5b融合蛋白，并用GSTrap柱进行纯化，得到高纯度的融合蛋白，并以此作为抗原，免疫新西兰白兔，取血清检测效价，获得效价为1：5000的抗血清。再用Protein-A/CL-4B树脂亲和层析纯化抗血清，得到浓度为1.5μg/μ1的抗体。 为了研究水稻OsRab5b蛋白在烟草保卫细胞中的功能，首先在烟草中过量表达OsRab5b，通过westernblot检测，筛选出高表达量的转基因株系。与非转基因株系相比较，OsRab5b过量表达转基因株系的叶片易萎蔫，经过叶片的生理分析和叶表皮的细胞学观察，发现在逆境条件下，的气孔关闭延迟而导致较高的蒸腾速率，使叶片过度失水而产生萎蔫。用ABA诱导非转基因株系和过量表达转基因株系叶片的下表皮，非转基因株系的气孔在ABA诱导下正常关闭，而过量表达转基因株系的气孔失去了对ABA的敏感性。向过量表达OsRab5b的转基因植株中导入RNA干涉载体，经western检测，证实转基因植株中的OsRab5b的表达发生沉默，沉默转基因株系所表现各种现象均与非转基因株系一致。用荧光染料FMl-43标记叶的下表皮细胞膜，用激光共聚焦扫描显微镜观察气孔保卫细胞的内吞作用。在ABA的诱导下，烟草和蚕豆的气孔保卫细胞在关闭过程中，内吞作用明显加速；而用高渗透压代替ABA时，内吞加速不如ABA诱导显著。ABA处理转基因烟草，非转基因株系与沉默转基因株系的保卫细胞正常关闭，并伴随着内吞作用明显加速；而过量表达株系的内吞作用明显变慢，而且气孔关闭不严。这说明OsRab5b在烟草中过量表达阻碍气孔保卫细胞的正常内吞作用，从而使气孔关闭受阻。 本研究利用植物特异性Rab5b蛋白具有保守区的特点，采用Clustalw软件将四种植物特异性Rab5b蛋白(百脉根LiRab5b、龙船海棠McRab5b、拟南芥Ara6和水稻OsRab5b)进行多重序列比较，找到保守区，根据保守区序列设置引物，从烟草中扩增到一段400bp的片段，经测序分析，该序列与其它植物特异性Rab5bcDNA的同源性很高。采用RT-PCR和3’RACE方法获得其全长cDNA编码区。经软件分析，该cDNA所编码的蛋白具有植物特异性Rab5b的特点，因此，命名为NtRab5b。将植物特异性Rab5b与植物Rab5a及动物Rab5蛋白的序列进行了比较，发现烟草NtRab5b蛋白具Rab蛋白家族的共性，即有Rab特异序列(YYRGA)，四个与GTP结合相关的功能基序(GB1-GB4)，一个与其蛋白效应子相结合的效应子基序(AIB)，这些基序都是Rab蛋白行使功能所需的。但与人及动物不同的是，植物特异性Rab5b的C末端缺乏与膜结合的基序，而在N末端有类似异源三体G蛋白α亚基N端的与膜结合的功能基序。采用SWISS-MODEL程序进行同源建模的结果表明，烟草NtRab5b和水稻OsRab5b的三维结构相似，但与LjRab5b有较大的差异。 进一步研究了OsRab5b-GFP和NtRab5b-GFP及各自的突变体-GFP融合蛋白在烟草保卫细胞中的亚细胞定位情况，对Rab5b的功能进行了初步的分析。利用生物学软件对水稻和烟草的两种植物特异性Rab5b蛋白进行分析，发现它们的N端有叶绿体导肽功能的可能性。将NtRab5b及OsRab5b及其突变体NtRab5b(G2A)及OsRab5b(G2A)与GFP融合后，转化烟草，观察融合蛋白在保卫细胞中的定位。结果表明：四种融合蛋白都能与细胞质膜结合，而GFP不与细胞膜结合，提示植物特异性Rab5b蛋白很可能参与保卫细胞的内吞过程。NtRab5b-GFP位于叶绿体和细胞质中，OsRab5b-GFP融合蛋白只进入到叶绿体中，这与软件预测的结果一致；而NtRab5b(G2A)-GFP与OsRab5b(G2A)-GFP融合蛋白却都不能进入到叶绿体中，说明植物特异性Rab5b蛋白的N端与蛋白质能否进入叶绿体有关，具有叶绿体导肽的功能。在ABA诱导作用下，烟草气孔保卫细胞中过量表达NtRab5b和NtRab5b-GFP时，气孔能正常关闭，保卫细胞内吞作用正常加速，与未转基因烟草的气孔开关行为一致；而过量表达NtRab5b(G2A)、NtRab5b(G2A)-GFP、OsRab5b和OsRab5b-GFP及OsRab5b(G2A)-GFP的气孔保卫细胞内吞作用受阻，气孔的关闭也受到影响。这些结果表明，植物特异性Rab5b蛋白N端第2位氨基酸是该蛋白调节内吞作用所必需的，NtRab5b参与调节ABA诱导气孔关闭过程中的内吞作用。 另外，在构建植物表达载体过程中发现一个在植物中表达的农杆菌章鱼碱合成酶(ocs)基因的终止子在原核生物中具有启动子功能，并对其启动子活性进行了系统地研究。已知的农杆菌T-DNA区基因都在植物冠瘿瘤细胞中表达，与冠瘿瘤的形成有关。将ocs基因3’区约800bp的片段与报告基因hptⅡ和gusA连接，转入大肠杆菌和农杆菌后，进行了潮霉素抗性分析和荧光定量分析后发现ocs基因3’区有原核启动子活性，但比CaMV35S启动子的活性要弱。将带有报告基因的表达载体转入到烟草中进行分析时发现，ocs基因3’区不具有真核启动子活性。利用生物学软件分析ocs基因3’区的下游至T-DNA区右边界的序列，发现在其下游存在一个编码142个氨基酸的开放阅读框架ORF12，它与ocs基因编码链部分互补重叠。对野生型农杆菌进行了RT-PCR分析，表明ORF12基因在农杆菌中有微量表达，而ocs基因在农杆菌中不表达。这样一对原核表达和真核表达的基因相互反向重叠，可以经济而合理地利用遗传信息。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图目录、表目录、缩略词表

第1章前言

1.1文献综述

1.1.1小GTP结合蛋白—信号转导的分子开关

1.1.2 Rab家族蛋白—细胞内膜运输的调节者

1.1.3 Rab5亚类蛋白—细胞内吞的关键因子

1.1.4植物中的Rab蛋白及其生理功能

1.1.5植物细胞的内吞作用

1.1.6气孔运动及其与保卫细胞的内吞作用的相互关系

1.2本论文研究的目的

第2章水稻OsRab5b基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备

2.1前言

2.2结果

2.2.1 GST-OsRab5b融合蛋白在大肠杆菌中的表达

2.2.2 GST-OsRab5b融合蛋白的纯化

2.2.3抗血清的获得及抗体的纯化

2.3讨论

2.4材料与方法

2.4.1材料

2.4.2仪器及设备

2.4.3试剂及培养基的配制

2.4.4融合蛋白的诱导表达

2.4.5 SDS-PAGE电泳

2.4.6 GST-OsRab5b融合蛋白的亲和层析纯化

2.4.7抗血清的制备

2.4.8抗血清的效价测定

2.4.9抗体的纯化

第3章烟草中过量表达水稻OsRab5b基因影响气孔的正常关闭

3.1前言

3.2结果

3.2.1植物表达载体的酶切鉴定

3.2.2转基冈植物的PCR检测

3.2.3 OsRab5b基因在烟草中的过量表达及沉默的Western印迹分析

3.2.4 OsRab5b基因的过量表达影响气孔关闭而导致水分过多丧失

3.2.5 ABA不能诱导OsRab5b过量表达株系的气孔正常关闭

3.2.6 ABA诱导保卫细胞的内吞作用

3.2.7 ABA的诱导不能有效地促进OsRab5过量表达植株保卫细胞的内吞作用

3.3讨论

3.4材料与方法

3.4.1材料

3.4.2主要仪器及设备

3.4.3主要试剂及培养基的配制

3.4.4大肠杆菌感受态制备及转化

3.4.5质粒的微量提取及酶切鉴定

3.4.6回收DNA片段(低熔点琼脂糖法)

3.4.7 PCR片段与T载体的连接反应

3.4.8植物表达载体的构建

3.4.9农杆菌感受态制备及电击法将质粒转入农杆菌

3.4.10农杆菌质粒的小量提取

3.4.11农杆菌介导法转化烟草

3.4.12植物DNA的小量提取

3.4.13转基因烟草的PCR检测

3.4.14烟草叶片总蛋白的提取及含量测定

3.4.15转基因植物的Western印迹分析

3.4.16蒸腾速率及萎蔫性分析

3.4.17气孔孔径测量

3.4.18 ABA诱导处理

3.4.19用荧记染料标记保卫细胞膜

3.4.20激光共聚焦扫描显微分析

第4章烟草NtRab5b基冈编码区的克隆及植物特异性Rab5b蛋白序列的功能基序分析

4.1前言

4.2结果

4.2.1 NtRab5b基冈全长cDNA编码区的扩增及其克隆

4.2.2植物特异性Rab5b蛋白质序列与功能基序分析

4.2.3植物特异性Rab5b蛋白的三维结构模型

4.3讨论

4.4材料与方法

4.4.1材料

4.4.2主要仪器及设备：

4.4.3主要试剂的配制

4.4.4 TRIZOL法提取植物总RNA

4.4.5 RT-PCR反应

4.4.6回收DNA片段(低熔点琼脂糖法)

4.4.7 DNA及蛋白质序列分析

第5章水稻OsRab5b及烟草NtRab5b蛋白在烟草气孔保卫细胞中的功能

5.1前言

5.2结果

5.2.1生物学软件预测植物特异性Rab5b蛋白在植物细胞中的亚细胞定位

5.2.2植物表达载体的酶切鉴定

5.2.3转基因烟草的PCR检测

5.2.4植物特异性Rab5b蛋白能与细胞膜结合

5.2.5植物特异性Rab5b蛋白N端与其进入叶绿体有关

5.2.6在气孔关闭过程中，植物特异性Rab5b蛋白参与气孔保卫细胞的内吞作用

5.5 讨论

5.4材料与方法

5.4.1材料

5.4.2实验仪器及设备

5.4.3主要试剂及培养基的配制

5.4.4生物学软件分析

5.4.5引物设计及PCR扩增

5.4.6植物表达载体的构建

5.4.7转基冈烟草的PCR检测

5.4.8激光共聚焦扫描显微镜观察烟草的气孔保卫细胞

第6章农杆菌T-DNA区真核表达基因OCS终止子在原核中具有启动子的活性

6.1前言

6.2结果

6.2.1载体的酶切鉴定

6.2.2 ocs基因3′区在大肠杆菌中的启动子活性分析

6.2.3 ocs基冈3′区在农杆菌中的启动子活性分析

6.2.4T-DNA区开放阅读框架(ORF)的分析

6.2.5 ORF12基因在农杆菌中的表达

6.3 讨论

6.4材料与方法

6.4.1材料

6.4.2主要仪器及设备

6.4.3主要试剂及培养基的配制

6.4.4载体构建

6.4.5大肠杆菌的潮霉素抗性分析

6.4.6农杆菌的潮霉素抗性分析

6.4.7大肠杆菌GUS表达活性荧光定量分析

6.4.8烟草转化、潮霉素抗性分析及组织化学染色检测

6.4.9软件分析开放阅读框架

6.4.10农杆菌总RNA提取及RT-PCR

6.4.11Northern杂交分析

第7章结论与展望

参考文献

附录 作者在攻读博士学位期间完成的学术论文

致谢

原刨性声明