耻骨联合软骨细胞作为组织工程种子细胞的实验研究

摘要

耻骨间盘与关节盘都是纤维软骨组织，从耻骨联合的软骨组织中是否能够分离获取有活性的细胞、在体外培养、与支架材料复合生长、并在体内异位形成软骨组织，是其能否作为构建组织工程化关节盘种子细胞供体，所必须要首先探讨的问题。 本实验对耻骨联合及其分离的细胞进行系列研究，探讨耻骨联合软骨细胞是否能够作为组织工程种子细胞，为进一步的组织工程构建关节盘做准备。 本实验共分为三个部分： 实验一：耻骨联合软骨的形态学研究 通过对取自SD大鼠的耻骨联合软骨组织行HE染色、阿尔辛兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察到耻骨联合软骨组织中有大量平行和交叉排列的纤维束，软骨细胞较小，胞浆嗜碱性着色，呈圆形、卵圆形或短梭形，位于陷窝内，分布于纤维束之间，多为成对存在，或排列成行。细胞及软骨陷窝附近阿尔辛兰染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色着色深，而细胞外间质部分着色较浅。通过对骨盆标本的测量，发现成年男性的耻骨联合软骨为一个前部较厚、后部较薄的楔形片状组织，软骨组织量约为1.13cm3。 实验二：耻骨联合软骨细胞体外培养及细胞学研究 观察从耻骨联合软骨组织中分离的细胞，在体外培养过程中的表型、生长增殖情况。结果表明：经胶原酶分别消化2、6、12h后，平均每100mg耻骨联合软骨在不同消化时间获取的原代细胞数之间有统计学显著差异(P＜0.01)。消化6小时组可以获取约(3.03±0.208)×106细胞，生长状态好。细胞浆内质网发达，线粒体较丰富。第1代细胞阿尔辛兰染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性。Ⅱ型胶原免疫组化染色在第4代细胞仍呈阳性，而在第7代呈阴性。第1、4代细胞PDT分别为55.5h、56.9h，第7代细胞中梭形、肥大的细胞增多，生长增殖速度明显减弱，PDT为134.2h。 实验三：耻骨联合软骨细胞与支架复合培养的实验研究 按5×107个细胞每毫升藻酸钠溶液混合，制备细胞藻酸盐凝胶复合物，观察细胞在复合物中的活性，再将细胞凝胶复合物植入裸鼠背部皮下，观察在体内异位形成软骨组织的情况。结果见，细胞分散悬浮在凝胶支架中，细胞存活率为72.4％±4.5％，保持一定的增殖能力，并可逐渐增殖形成细胞团块。细胞支架复合物在植入体内6周和12周时，经阿尔辛兰染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色证实，形成了软骨岛样结构。 结论：耻骨联合软骨组织体积较大，可以提供较多的软骨组织用来分离细胞。从SD大鼠耻骨联合软骨分离获取的细胞具有较强的适应性和增殖能力，可以在体外进行原代和传代培养。单层培养条件下，第4代及以前的细胞保留了软骨细胞的基本表型特征，增殖较快。在藻酸盐凝胶支架中，细胞存活率较高，仍保持一定的增殖活性。并且，细胞凝胶复合物具有在体内异位形成软骨的能力。

目录

关键词

前言

实验一 耻骨联合软骨的形态学研究

实验二耻骨联合软骨细胞体外培养及生物学特性

实验三 耻骨联合软骨细胞与支架复合培养的实验研究

全文总结

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