人胚胎干细胞建系、鉴定及培养条件的优化

摘要

人胚胎干细胞(ES)是来源于人囊胚中分离的内细胞团，具有发育的多潜能性，并能够在体外无限繁殖且保持未分化状态，在移植或体外适当培养条件下能够自发分化为内、中、外三个胚层的多种类型细胞。利用人ES细胞，可以研究早期胚胎细胞的发育过程，可以为临床提供器官移植、修复器官或组织的原材料，为基因治疗提供载体，同时也可作为药物筛选的模型。 1.两株人胚胎干细胞系的建立及生物学特性的鉴定 虽然人ES细胞具有重要的研究及临床应用价值，但现在能够用于研究的，具有不同遗传背景的人胚胎干细胞株数目是有限的。为了建立更多的，不同遗传背景的人胚胎干细胞，本实验探讨用临床移植后的剩余卵裂胚建立人胚胎干细胞系。 收集临床移植后剩余卵裂胚50例，所收集卵裂胚均为临床采卵3天进行胚胎移植后剩余卵裂胚，其临床评分并不高，将其放入G2.3培养基中培养发育至囊胚，在研究中我们在G2.3培养基加入了人重组LIF，以利于内细胞团细胞的充分增殖并抑制其分化。待卵裂胚发育至囊胚后，用链霉蛋白酶去除透明带，用兔抗人全血清及豚鼠补体血清去除无透明带的囊胚滋养外胚层细胞，得到内细胞团，将分离的内细胞团接种经灭活处理的鼠胚成纤维细胞的饲养细胞层上，待原代克隆生长7～10天后传代，扩大培养。通过碱性磷酸酶(AKP)染色，胚胎干细胞特异性标志物检测，染色体核型分析和体内外分化实验，对连续传代的细胞进行鉴定。 用临床移植后的剩余卵裂胚，在体外建立了2株人胚胎干细胞，命名为SYSU-1和SYSU-2。两细胞株所形成克隆，形态较扁平，克隆内细胞界限清楚，折光性强，细胞呈圆形，核质比大。对两株细胞进行了生物学特性的检测，发现两株细胞AKP(碱性磷酸酶)阳性表达，人胚胎干细胞共有的特异性表面标志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60阳性表达而小鼠胚胎干细胞特异性标志物SSEA-1表达阴性，同时表达Oct4，rexl，nanog。两细胞株长期培养具有正常的、稳定的二倍体核型，将2个细胞系接种到裸鼠体内，6周后，有一株形成畸胎瘤。 用临床移植后剩余胚胎，在体外成功建立了2个胚胎干细胞系，长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。 2.用人胎儿骨髓间质干细胞作饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立 长期培养人胚胎干细胞传统需要采用鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层来维持其未分化状态，但鼠源性饲养层会带来异源性蛋白的污染，继而限制了人胚胎干细胞广泛的临床应用。为了避免异源性蛋白对胚胎干细胞的污染，很多研究尝试用人胎儿皮肤细胞，人胎儿肌细胞，人成体输卵管上皮细胞和成体骨髓间质细胞作为饲养层来培养人胚胎干细胞。但至今，未发现用人胎儿骨髓间质干细胞作为饲养层来培养人胚胎干细胞。 本研究采用胎儿骨髓间质干细胞作为饲养层来培养人胚胎干细胞(SYSU-1hES)，通过实验发现，用胎儿骨髓间质细胞干细胞作为饲养层来培养的SYSU-1hES细胞在体外连续传16代仍维持其未分化状态，对该细胞株进行了生物学特性的检测，各种人胚胎干细胞生物学特性均无改变。如：该株细胞AKP(碱性磷酸酶)阳性表达，人胚胎干细胞共有的特异性标志物SSEA-4，Tra-1-60阳性表达，而小鼠胚胎干细胞特异性标志物SSEA-1表达阴性，同时表达Oct4，rexl，nanog基因。细胞株长期培养具有正常的、稳定的二倍体核型，将该细胞系接种到裸鼠体内，10周后，形成畸胎瘤，取出畸胎瘤组织制作石蜡切片，镜下可见来源于内、中、外三个胚层的组织，说明该细胞系仍具有多向分化潜能。 我们研究提示，胎儿骨髓间质干细胞可作为饲养层来培养人胚胎干细胞，这为人胚胎干细胞的临床应用提供了可能。

目录

关键词

Section 1 Establishment and Characterization of Two Human Embryonic Stem Cell Lines, SYSU-1 and SYSU-2

Section 2 Maintenance and Expansion of Human Embryonic Stem Cells on Human Fetal Mesenchymal Stem Cells as Feeder Layer

全文结论

附图

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致谢