降解邻苯二甲酸二乙酯低温盐碱菌的筛选及降解酯酶基因的克隆

摘要

邻苯二甲酸酯(Phthalateesters，简称PAEs)是一类广泛使用的化合物，主要用于聚氯乙烯树脂的合成、粘胶剂、塑料薄膜的生产。近年来，由于PAEs的大量使用，这类化合物广泛存在于水体、大气、土壤等环境中，对人类健康、其它生物和环境的危害引起了人们的普遍关注。PAEs危害人体和野生动物正常激素的分泌，导致内分泌功能紊乱、生长发育异常、出生缺陷和肿瘤发生率增加、生殖能力下降等危害，被列入内分泌干扰物质。因此，如何有效控制和消除环境内PAEs引起的污染己成为当务之急。 本论文从油田废坑样品中分离得到6株能以环境内分泌干扰物质邻苯二甲酸二乙酯为唯一碳源生长的细菌，选取其中降解邻苯二甲酸二乙酯效率最高的菌株L6为研究对象。通过对降解菌株L6的形态、生理生化特性和16SrDNA分子鉴定，发菌株L6的16SrDNA序列与NCBI中Halomonassp.的有很高的同源性，其中与菌株Halomonassp.IB-559有99％的同源性。因此，将菌株L6的初步鉴定为Halomonassp.属，命名为Halomonassp.L6。在温度为4℃-35℃，NaCl浓度为0％-25％，pH为6-12的范围内该菌株均能生长，其最适生长温度为30℃，最适盐浓度为5％，最适pH为9.0。根据极端环境微生物的分类，菌株L6属于耐冷的中度嗜盐嗜碱菌。除此之外，还研究了碳源、氮源、金属离子、通气量等其它外界条件对菌株Halomonassp.L6生长的影响。菌株Halomonassp.L6产生的邻苯二甲酸二乙酯的降解酯酶为胞内酶。通过对粗酶液的酶活性及耐受性的研究发现，该酶的最适反应温度为30℃，最适反应最适pH为9.0，最适NaCl浓度为4％，与该菌生长的最适温度、pH均一致。 本论文以pUCl8为载体成功构建了菌株Halomonassp.L6的基因组DNA文库。利用酯酶水解X-caprylate产生蓝色产物的特点，高效筛选到包含目的酯酶基因的阳性克隆子5B-68。该克隆子经酶切和测序分析，插入约6kb的外源片段，BLAST比对后发现：该片段中包含多个ORF，其中一个ORF长度为432bp，编码143个氨基酸残基的蛋白，该蛋白与NCBI中登录的PaaIthioesterase有93.8％的同源性。此外，通过降解实验表明，该序列表达蛋白能降解邻苯二甲酸二乙酯。因此，我们可以确定该酶为目的酯酶。 鉴于本论文筛选的降解菌L6具有较广泛的生长温度、盐浓度、pH、底物降解谱以及对多种金属离子都有比较强的耐受性。因此该菌株的开发利用可以用来解决因PAEs有机物引起的环境污染问题。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第1章前言

第2章降解邻苯二甲酸二乙酯低温盐碱菌的分离、筛选及鉴定

第3章低温盐碱菌Halomonas sp.L6生理生化特性的研究

第4章邻苯二甲酸二乙酯降解酯酶的特性研究

第5章邻苯二甲酸二乙酯降解酯酶基因组文库的构建及筛选

总结

参考文献

致谢

原创性声明

附加：硕士期间发表论文情况