Survivin在糖尿病小鼠胰腺中的表达及其过表达对NIT-1细胞凋亡的影响

摘要

本文内容分为两部分：研究STZ诱导糖尿病小鼠模型胰腺survivin基因的表达情况；同时给予STZ小鼠Ex处理，了解Ex对survivin表达的影响以及survivin是否与Ex抗凋亡有关。另一方面，利用分子生物学技术，将survivin基因导入胰岛素分泌细胞，使胰岛素分泌细胞高度表达survivin，然后暴露于凋亡诱导因子的环境，以探求survivin是否具有保护胰岛素分泌细胞的作用。 第一部.分链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型胰腺survivin基因的表达及exendin-4对其的影响 一、研究目的 建立连续多次小剂量STZ注射诱导糖尿病小鼠模型，探讨STZ诱导糖尿病小鼠成模过程中的不同时间点胰腺survivin基因mRNA的表达情况，并了解Ex对其的影响。 二、研究方法 1、实验动物分组与处理：6周龄雄性Balb/c小鼠稳定饲养1周后随机分为三组：(1)STZ组第1-5天腹腔注射STZ40mg/kg，STZ注射前2天始连续10天腹腔注射生理盐水。(2)Ex组第1-5天腹腔注射STZ40mg/kg，STZ注射前2天始连续10天腹腔注射Ex24mol/kg。(3)对照组注射溶剂。每周测量体重、随机血糖，并于各时段取胰腺组织，-80℃保存或4％多聚甲醛固定。 2、胰腺组织HE染色、胰岛素和survivin的免疫组化检测 3、TUNEL检测胰岛细胞凋亡 4.实时荧光PCR检测胰腺组织survivin基因mRNA水平 5、RT-PCR产物进行核苷酸序列测定。 三、结果 1、小鼠体重、血糖的变化：对照组小鼠体重呈持续增加(P＜0.05)。STZ组小鼠体重在4周内无明显改变(F=1.591，P=0.178)。与基础值比较，Ex组体重在第1周时下降，在第3、4周逐渐回升，但均无统计学意义(P＞0.05)。不同时间点的三组小鼠比较，处理前各组小鼠的体重差异无统计学意义(P＞0.05)；STZ组第1、3、4周体重均低于同龄的对照组(P＜0.05)；Ex组第1周体重低于同龄的对照组(P＜0.05)，而在继后的第2、3、4周时与对照组的差异未达统计学意义(P＞0.05)；第3和4周时Ex组的小鼠体重有高于STZ组的趋势，但P＞0.05。 2、胰腺组织学、免疫组织化学检测：HE染色示STZ组胰岛少而小。胰岛中胰岛素染色阳性面积百分比在对照组、STZ组和Ex组中分别为46.32±9.26％、25.47±9.26％和39.40±9.72％。三组间差异显著(F=57.02，P＜0.01)。两两比较，STZ组小于对照组，Ex组大于STZ组，但小于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。三组胰岛中均可见survivin染色阳性的细胞，胰腺外分泌腺及导管未见阳性染色。 3、TUNEL检测结果：正常对照组小鼠胰岛细胞凋亡数目很少，STZ注射可诱导小鼠胰岛细胞凋亡增加，STZ注射后4周Ex组胰岛细胞凋亡数目显著少于STZ组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。 4、实时荧光PCR检测胰腺组织survivin基因mRNA水平：对照组胰腺survivinmRNA水平稳定(P＞0.05)。STZ组1、2周survivinmRNA表达量与基础持平(P＞0.05)，第3、4周高于基础水平，也高于同时间点对照组水平，差异均有统计学意义(P＜0.05)。Ex组survivinmRNA表达量在第2周时无明显变化(P=0.94)，4周时升高，也高于同时期对照组和STZ组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 5、RT-PCR产物经测序表明与小鼠survivin基因序列100％吻合。 四、结论 1、STZ诱导糖尿病小鼠在STZ注射后3、4周胰腺survivinmRNA水平明显升高，提示survivin表达上调可能与胰岛β细胞修复再生有关。 2、Exendin-4可改善STZ诱导糖尿病小鼠的高血糖，增加胰岛中胰岛素染色阳性面积百分比，减少胰岛细胞凋亡，上调胰腺survivin表达，survivin可能在exendin-4抑制胰岛β细胞凋亡途径中起一定作用。 第二部分.转染survivin基因对NIT-1细胞凋亡的影响一、研究目的转染小鼠survivin基因到小鼠胰岛素分泌细胞系NIT-1细胞，研究过表达survivin基因对细胞因子诱导的细胞凋亡的影响，并了解其对NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能的影响。 二、实验方法 1、pcDNA3.0-GFP-Sur真核表达质粒的构建及鉴定 2、重组pcDNA3.0-GFP-Sur质粒稳定转染NIT-1细胞，并进行鉴定 3、细胞培养：实验采用小鼠胰岛素分泌细胞系NIT-1细胞(20-40代)，分为对照组、转染GFP组和转染GFP+小鼠survivin基因组。每大组再分为细胞因子干预亚组和非干预亚组，细胞因子干预组在细胞融合至50-70％时予IL-1β100U/ml+IFN-γ1000U/ml孵育48h。共6组如下：C组(NIT-1细胞)、CC组(NIT-1细胞、细胞因子干预)、GFP组(表达GFP)、GFP-C组(表达GFP、细胞因子干预)、SUR组(表达survivin)和SUR-C组(表达survivin、细胞因子干预)。相同实验条件重复4次。 4、凋亡检测：Hoechst33342染色、TUNEL及流式细胞仪检测亚二倍体峰。 5、survivin基因过表达对NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能的影响。 三、结果 1、重组pcDNA3.0-GFP-sur质粒的构建与鉴定双酶切鉴定重组pcDNA3.0-GFP-sur质粒，电泳示与理论值相符。测序结果显示插入片段与小鼠survivin基因cDNA序列(序列号：009689)一致，全长编码区内无核苷酸突变。 2、稳定转染小鼠survivin基因NIT-1细胞的鉴定(1)实时荧光RT-PCR检测稳定转染细胞survivin基因的表达，显示SUR组survivinmRNA水平升高了5倍左右。 (2)Westernblot检测NIT-1细胞survivin蛋白表达，结果示SUR组16.5kD处的特异蛋白条带明显增强，差异有统计学意义。 3、凋亡检测：Hoechst33342染色、TUNEL检测及流式细胞仪检测Hoechst33342染色、TUNEL及流式细胞仪检测亚二倍体峰显示比较一致的结果，转染与细胞因子干预两因素之间存在明显的交互效应(三种检测方法均为P＜0.01)。细胞凋亡率在每大组内细胞因子干预亚组高于非干预亚组，均为P＜0.01。在非细胞因子干预的各亚组之间细胞凋亡率差异无统计学意义(均为P＞0.05)。细胞因子干预的各亚组中，SUR-C组低于CC组(Hoechst33342染色示5.78±0.81％vs10.69±1.35％，P＜0.01；TUNEL检测示6.31±0.77％vs16.76±3.02％，P＜0.01；亚二倍体峰9.67±2.36％vs16.56±0.9％，P＜0.01)，SUR-C组低于GFP-C组(Hoechst33342染色示5.78±0.81％vs10.64±1.33％，P＜0.01；TUNEL检测示6.31±0.77％vs16.87±2.24％，P＜0.01；亚二倍体峰9.67±2.36％vs17.27±3.53％，P＜0.01)。此外，SUR-C组高于C组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 4、过表达survivin对NIT-1细胞胰岛素分泌功能的影响各组细胞胰岛素分泌水平分别为：C组为2.74±0.35μg/g蛋白，CC组为1.08±0.17μg/g蛋白，GFP组为2.36±0.32μg/g蛋白，GFP-C组为0.96±0.13μg/g蛋白，SUR组为2.47±0.32μg/g蛋白，SUR-C组为1.43±0.54μg/g蛋白。胰岛素水平在每大组中细胞因子干预亚组低于非干预亚组，差异有统计学意义(P值均小于0.01)。在非细胞因子干预的三个亚组中胰岛素水平的差异无统计学意义(F=1.391，P=0.298)。在细胞因子干预的三个亚组中，SUR-C组胰岛素水平高于CC组和GFP-C组，但差异未达统计学意义(1.43±0.54vs1.08±0.17，P=0.157；1.43±0.54vs0.96±0.13，P=0.061)。SUR-C低于C组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 四、结论 1、建立了稳定转染survivin基因并表达survivin蛋白的小鼠胰岛素分泌细胞系NIT-1细胞。 2、转染survivin基因可部分抑制细胞因子IL-1β和IFN-γ诱导的细胞凋亡。Survivin过表达有保护NIT-1细胞胰岛素分泌功能的趋势，但差异未达统计学意义。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型胰腺 survivin基因的表达及exendin-4对其的影响

第二部分 转染survivin基因对NIT-1细胞凋亡的影响

总结

附录

综述 胰岛β细胞凋亡:两型糖尿病发病的共同病理基础

致谢