垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究

摘要

垂体腺瘤是颅内常见肿瘤，约占12～15％，半数病例具有侵袭性。侵袭性垂体腺瘤多为大腺瘤，具有向周围正常结构如海绵窦侵袭性生长的特点，导致其全切率低、复发率高，一直是神经外科的治疗难点。要探索一种治疗侵袭性垂体瘤的有效途径就需要更深入的研究侵袭性垂体瘤的发病机理及相关生物学特性。国内外学者通过临床病理及分子生物学技术希望找出具有高残留率、高复发风险的侵袭性垂体瘤的生物学标志，为进一步研究如何根治侵袭性垂体瘤创造理论基础。近年来垂体瘤侵袭性的研究主要集中在肿瘤细胞本身异常方面，如：细胞中的染色体异常，相关的癌基因、抑癌基因等，拟从肿瘤细胞内部找出侵袭标记，但到目前为止，还没有可靠的标记物能预测肿瘤的生物学行为。我们知道，肿瘤的形成、生长、侵袭等亦受细胞外因素的影响，血管形成与肿瘤侵袭都需要细胞外基质成份的降解和细胞移动，在垂体腺瘤侵袭性机制的研究中对肿瘤间质成分研究甚少。我们从垂体腺瘤的细胞培养入手，以侵袭性垂体腺瘤的间质成分为重点，探讨其侵袭性机制。 第一部分人垂体腺瘤细胞原代培养的纯化及其激素的表达与分泌的研究 目的 探讨原代培养垂体腺瘤的细胞纯化方法及其激素表达与分泌的特点。 方法 采用三种原代培养方法对垂体腺瘤细胞进行培养，方法Ⅰ为目前常用的垂体瘤细胞培养方法；方法Ⅱ结合使用右旋颉氨酸(D-valine)替代左旋颉氨酸(L-valine)的DMEMD-valine培养液；方法Ⅲ采用反复贴壁法结合DMEMD-valine培养液培养。观察其细胞形态变化和生长特征，放射免疫法测定不同培养时间培养液中相应激素的水平。免疫组织化学染色法检测培养细胞生长激素(growthhormone，GH)、泌乳素(prolactin，PRL)的表达。 结果 3种方法均能成功培养出垂体腺瘤细胞，呈圆形或椭圆形，其纯度随培养时间的延长逐渐下降，培养第20d其平均纯度分别为40％，46％，96％。方法Ⅲ明显高于方法Ⅰ和方法Ⅱ，差异具有显著性意义(P＜0.01)；培养液中均含有相应激素，且3种方法的激素分泌量没有统计学差异(P＞0.05)；腺瘤细胞分别呈GH，PRL阳性表达，成纤维细胞表达Ⅰ型胶原。 结论 方法Ⅲ可得到纯度达95％以上的人垂体腺瘤细胞，纯化后的细胞可分别呈GH和PRL阳性表达并具有良好的激素分泌功能，为进一步研究人垂体腺瘤的发病机理、药物治疗和颅外移植等方面奠定了实验基础。 第二部分侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的增殖及凋亡比较 目的 分析比较侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤原代细胞培养中成纤维细胞的增殖及凋亡的差别，探讨成纤维细胞在垂体腺瘤侵袭性生长中的作用。 方法 分别对10例侵袭性和10例非侵袭性垂体腺瘤组织进行原代和传代细胞培养，对成纤维细胞进行形态学及细胞增殖速度观察，免疫组织化学染色法检测成纤维细胞Ⅰ型胶原和波形蛋白的表达，比较两组成纤维细胞的DNA合成代谢，流式细胞仪(FCM)检测两组成纤维细胞凋亡。 结果 侵袭性垂体腺瘤原代细胞培养过程中，第1～2天即可见到成纤维细胞，到第8天左右几乎长满单层。非侵袭性垂体腺瘤原代细胞培养过程中，第10天左右才可见到极少数的成纤维细胞生长，1个月后长满单层。成纤维细胞呈Ⅰ型胶原及波形蛋白阳性表达，侵袭组成纤维细胞的DNA合成量明显高于非侵袭组成纤维细胞(t=28.28，P＜0.05)。侵袭组细胞凋亡占细胞总数的(1.4±0.4)％，非侵袭组凋亡细胞占总数的(5.8±1.2)％，两组差别有统计学意义(t=11.00，P＜0.05)。 结论 侵袭性垂体腺瘤中的成纤维细胞增殖快，凋亡少，垂体腺瘤的侵袭性生长可能与成纤维细胞的增殖有关。 第三部分侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的体外培养及生物学特性的研究 目的 建立人侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞分离培养的方法，研究其生物学特性，探讨其在垂体瘤侵袭性生长中的作用。 方法 差速贴壁筛选法分离培养侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞，进行原代及传代培养，倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性，免疫组化染色进行成纤维细胞鉴定，MTT法绘制传代细胞的生长曲线，电镜观察其超微结构。 结果 侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力。细胞胞体较大，形态不规则，细胞质中可见丰富的粗面内质网和核糖体，高尔基复合体发达，Ⅰ型胶原及波形蛋白表达率在95％以上。 结论 成功培养出侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞，本研究为进一步探讨侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的生物学特性及垂体腺瘤侵袭性机制的研究提供了实验模型。 第四部分垂体腺瘤间质成纤维细胞活化蛋白的表达及其意义 目的 探讨成纤维细胞活化蛋白(fibroblastactivationprotein,FAP)在人垂体腺瘤间质中的表达特点及与其侵袭性的关系。 方法 连续收集10例非侵袭性和10例侵袭性垂体腺瘤标本，对标本进行HE染色，免疫组化SP法检测垂体腺瘤间质中FAP的表达，同时对10例侵袭性垂体腺瘤组织进行细胞培养，S-P法检测培养出的成纤维细胞FAP的表达。 结果 FAP在侵袭性垂体腺瘤间质中的阳性表达率为100％，非侵袭性垂体腺瘤中仅有1例呈阳性表达。所培养的侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞FAP的阳性表达占95％以上。 结论 FAP在间质中的高表达可能在垂体腺瘤的侵袭性生长过程中起重要作用，检测FAP的表达可作为临床判断垂体腺瘤侵袭性的一项指标。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 人垂体腺瘤细胞原代培养的纯化及其激素的表达与分泌的研究

第二部分 侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的增殖及凋亡比较

第三部分 侵袭性垂体腺瘤成纤维细胞的体外培养及生物学特性的研究

第四部分 垂体腺瘤间质成纤维细胞活化蛋白的表达及其意义

结论

参考文献

中英文对照表

附 图

本研究的创新和不足

致 谢