动态激光散射测量纯化蛋白粒径及对粒径与分子量关系的研究

摘要

本课题主要建立了一套动态激光散射装置，对测量光路进行了调试校准；对动态激光散射原理进行了分析，对数据分析方法进行了比较；就动态激光散射技术在生物大分子颗粒粒径及其分布、分子量与粒径之间的对应关系等多个方面的研究应用进行实验和讨论，通过对纯化蛋白样品的测试，并且结合相应的数据分析方法从而得出适合于测试纯化的蛋白样品的数据分析方法，与传统的纳米颗粒测试相比，该研究是专门针对于生物大分子的，我们预期通过这种针对性的研究，将进一步提高生物大分子体系中样品粒度及其分布的测量结果的可靠性和精度. 实验仪器和数据处理：实验采用自主建立并装配的一动态激光散射装置，动态光散射(DLS)是利用处于布朗运动中的生物大分子、分子集团或颗粒的散射光的强度随时间而波动的情况，来分析其在溶液中的粒子大小、尺寸分布等聚合方面性质的.散射光强度的波动用自相关函数来分析，分析软件提供单指数分析方法(Exponentialsampling)、累计分析方法(CumulantAnalysis)、双指数分析方法(DoubleExponential)、非负约束的最小二乘分析方法(Non-NegativelyConstrainedLeastSquares：Multiplepass)、修正的非负约束的最小二乘分析方法(Non-NegativelyConstrainedLeastSquares：Regularized)五种分析方法.对于单分散体系，光强的时间相关函数为：G(2)(τ)=A(1+β|g(1)(τ)|2)A为基线，理论上为1.0，β仪器常数，τ衰减时间，散射向量q=4πnsin(θ/2)，n为折射率，θ为散射角.从自相关函数的衰减率可以直接得到平移扩散系数D，流体动力学半径RH可由D通过Stokes-Einstein方程导出RH=kBT/6πηD，其中kB为波尔兹曼常数，T为绝对温度，η溶液的粘度. 实验样品与试剂：聚苯乙烯微球水悬浮液购自中国石油大学重质油国家重点实验室，用于校正光路.纯化的马血清球蛋白和纯化的卵黄抗体由公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室提供. 实验内容： ①建立一套动态激光散射装置. ②调整设置光路，通过对光路中光源偏振状态的监测、pinhole的设置.使得光路参数调整到最佳状态.然后对标准样品进行测量，标准样品为单分散体系聚苯乙烯球乳状液，标准值为347±12nm. ③对动态激光散射原理进行分析. ④对数据分析方法进行比较. ⑤利用克隆技术得到纯化蛋白，用动态激光散射测量其粒径及其分布，找到粒径与分子量的对应关系. 实验结果： ①通过对聚苯乙烯微球水悬浮液的测量，该动态激光散射装置可以对纳米颗粒的粒径及其分布进行准确的测量. ②测量结果：实验结论：和传统的生物大分子分离检测技术相比较，动态激光散射技术有独特的优点：①动态激光散射技术能够在对生物样品未进行物理化学分离的情况下，研究其组分，各组分的平动扩散系数、粒径等参数.②动态激光散射技术检测生物大分子快速、无扰、高灵敏度、高分辨率. 通过本课题研究，得到如下结论： 1.我们建立的动态激光散射装置能够测量粒径大小，且通过对动态激光散射原理的分析，数据分析理论的比较和实验标准样品的测量，可得出NNLS和CONTIN算法所拟合的结果比较可靠和准确. 2.该动态激光散射装置能够测量纯化蛋白的粒径及其分布； 3.对纯化蛋白的测量结果表明，粒径越大，分子量越大；且在我们的测量范围内纯化蛋白粒径与分子量成指数单调递增关系； 4.该技术有望成为分子生物学研究领域中的一项新的测量技术.

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章动态激光散射理论

第3章数据分析理论

第4章实验材料和结果

第5章讨论和结论

参考文献

致谢

原创性声明