CLC-3蛋白在糖尿病大鼠主动脉平滑肌，肾脏及脑组织中的表达及变化的研究

摘要

研究目的：本课题拟采用分子生物学检测方法，在糖尿病形成的不同时期(2周、4周、8周、12周、16周)，观察大鼠主动脉平滑肌，肾脏皮质、髓质及脑组织CLC-3蛋白的表达。从分子生物学角度探讨在糖尿病高渗透压状态下，CLC-3蛋白如何发生变化。并探讨其可能机制，为揭示糖尿病时血管功能的损害机制及其药物研制的新靶点提供理论依据。 研究方法：选用50只200～250g正常雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ诱导成糖尿病后，随机分成五个时间点，即2周，4周，8周，12周和16周。另外取50只年龄、体重相匹配的正常雄性Wistar大鼠作为正常对照组。每个时间点处死动物十只。迅速取出各组主动脉、肾脏(皮质、髓质)及脑组织。取不同时期大鼠相应待测组织放入预冷的PBS缓冲液中，把动脉周围结缔组织剪干净去除血块洗三遍，加入三倍组织量的组织裂解液，在冰浴下用组织匀浆器匀浆，将组织完全裂解呈乳状，高速低温(4℃)离心机3000g，在4℃，离心5min，取上清后再次离心，肾脏皮质，髓质以及脑组织用PBS冲洗三遍后，离心机12000g在4℃，离心2min，取上清，将上清液置于EP管中，放入-80℃冰箱保存备用(可保存1周)。取少量蛋白上清液用考马斯亮兰法定量后，调整蛋白量，使每个加样孔中蛋白量相同。加入6×上样缓冲液(为上样液的1/5量)沸水中煮3-5分钟，迅速冰浴(0℃)3分钟，混匀。与5ulMarker一起进行SDS-PAGE电泳，约2h，电泳分离蛋白质然后卸下分离胶，置于电转缓冲液中平衡30min。转移到硝酸纤维素膜上，PBST洗脱液沈脱5min。将卸下的硝酸纤维素膜浸于封闭液(5％脱脂奶粉)中，室温下在摇床缓慢摇匀1小时，取出膜后，在将膜放入CLC-3多克隆抗体与β-actin抗体(混合液中，在摇床上缓慢摇匀孵育1小时，PBST室温洗脱1小时，将硝酸纤维素膜放入在HRP-结合的二抗室温下共同孵育1小时，PBST洗脱1小时，每3分钟取发光试剂盒中的发光底物溶液和增强剂溶液各0.25ml，加入去离子水稀释至5ml，混匀静置1分钟后，与膜作用3min，在暗室中，使X片感光。胶片用凝胶成像系统扫描分析灰度。 统计学处理： 所有实验数据均采用(-X)±S表示，组间分析用MicrosoftExcelt检验，p＜0.05视为有统计学意义。 试验结果： 1.用抗CLC-3的多克隆抗体在大鼠主动脉平滑肌，肾脏皮质与髓质以及脑组织上均检测到内源性CLC-3蛋白的表达，它们的分子量在80KDa-110KDa之间。 2.糖尿病大鼠主动脉平滑肌上CLC-3蛋白的表达在2周后升高，在第8周和12周时表达与对照组有显著性差异(P＜0.05). 3.糖尿病大鼠肾脏皮质上CLC-3蛋白的表达在第2周到12周时均升高，在第16周时表达降低，与对照组没有显著性差异。髓质上CLC-3蛋白的表达在第2周到16周时均降低，在第12周和16周时表达与对照组有显著性差异(P＜0.05)。 4.糖尿病大鼠脑组织上CLC-3蛋白的表达在第2周到16周时均升高，在第12周和16周时表达与对照组有显著性差异(P＜0.05)。 结论： 1.免疫印迹表明大鼠主动脉平滑肌，肾脏皮质与髓质以及脑组织上均检测到内源性CLC-3蛋白的表达，它们的分子量在80KDa-110KDa之间。 2.糖尿病大鼠发病早期第2周到第4周时主动脉平滑肌，肾脏皮质与髓质以及脑组织上CLC-3蛋白的表达与对照组均没有显著性差异，在中后期第8周开始有显著性变化。 3.糖尿病大鼠主动脉平滑肌，肾脏皮质及脑组织上CLC-3蛋白的表达在糖尿病不同时期基本升高，而髓质上CLC-3蛋白的表达是降低的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第一章前言

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

小 结

参考文献

致 谢

原创性声明