气液界面暴露培养在气态污染物毒效应研究中的应用

摘要

城市空气污染已经成为发达和发展中国家面临的一个严峻挑战，室内空气污染和室外空气污染的污染源越来越多，污染物的种类也逐渐增加，对健康的影响日益复杂，且各种污染物存在协同作用。甲醛是室内空气污染的典型代表，主要是来自于室内装潢材料以及家具。在建筑装饰材料中，甲醛的最主要来源是人工合成板材，人造板主要用脲醛树脂作为其粘合剂，脲醛树脂是一种由尿素和甲醛缩聚而成的氨基树脂胶粘剂，它会慢慢释放甲醛，时间可长达数十年。在高温及高湿环境下，脲醛树脂会加快水解，释放甲醛量增多，尤其是新制成的家具甲醛释放率最高。臭氧是个重要的空气污染物，也是光化学污染物的主要成分，主要由汽车尾气中的氮氧化合物、碳氢化合物、一氧化碳等在紫外线的作用下生成。臭氧和甲醛均可以导致急性肺损伤和慢性肺部疾病。急性暴露于环境水平臭氧的人或动物可以产生可逆的肺功能损伤和以中性粒细胞募集为特征的气道炎症。流行病学研究表明，臭氧和甲醛作为氧化型空气污染物的代表，与呼吸系统疾病的发病率和死亡率明显相关，长期低剂量暴露是呼吸系统疾病的重要危险因素。国内外研究表明甲醛和臭氧对机体呼吸系统、心血管系统、免疫系统均存在一定毒性作用，尤其两者均可以对气道上皮产生明显的氧化损伤，促使上皮细胞合成和分泌大量的炎症效应分子，诱发气道高反应性和气道炎症，导致哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等呼吸系统疾病。国内外对于气态污染物的体外研究比较少，尤其是难溶于水的气态污染物。因为缺乏合适的体外暴露系统以及细胞暴露于气体的方法，甲醛等易溶于水的气体的体外研究均通过将气体溶入培养基来实现，因为与人支气管上皮细胞生理条件下气态污染物的接触方式不同，所以结果缺乏说服力。传统的浸入式培养不利于支气管上皮细胞的分化，也无法应用于气态污染物体外暴露。近年来气液界面培养被逐渐用于气态污染物体外毒性研究，常用的气液界面培养方法有滚瓶培养、Coming Transwell培养皿培养、胶原凝胶气液界面培养，但是这三种方法运用于气态污染物毒效应研究时，特别是水中溶解度大的气体，比如甲醛，均有一定的缺陷。本研究以petri-PERM培养皿(透气不透水)建立的气态污染物体外暴露系统，评价该暴露系统运用于气态污染物体外毒效应研究的有效性，以支气管上皮细胞株：BEAS-2B为研究对象，探讨甲醛和臭氧对支气管上皮细胞的损伤效应，为人群甲醛和臭氧暴露的健康效应评价提供实验证据，并为环境标准的制定提供参考。研究目的1、利用人支气管上皮细胞株BEAS-2B和petri-PERM培养皿建立气态污染物的体外暴露系统，并且评价系统应用于气态污染物毒效应研究的有效性。 2、选择室内空气污染物的代表甲醛和室外空气污染的代表臭氧，利用新建立的气态污染物体外暴露系统研究臭氧和甲醛对支气管上皮细胞株BEAS-2B的损害，并观察petri-PERM培养皿的实际使用效果。 3、观察臭氧和甲醛对支气管上皮细胞株。BEAS-2B的氧化损伤效应和炎症效应分子分泌的关系，探讨支气管上皮细胞参与气道炎症的可能机制。 研究内容和方法1、研究内容1、1 支气管上皮细胞气液界面培养，构建臭氧和甲醛的支气管上皮细胞体外暴露系统，并评价暴露系统的可行性和有效性。 1、2支气管上皮细胞暴露于气态甲醛和臭氧后，细胞内GSSG和GSH含量的比值变化，细胞一氧化氮合成酶和超氧化物歧化酶活性，细胞培养基中IL-4和一氧化氮的浓度。 1、3抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸能否抑制臭氧和甲醛对支气管上皮细胞的氧化损伤和细胞毒性。 2、实验设计 实验分组：过滤空气暴露作为对照组，甲醛气体暴露设高剂量组(0.3m/m<'3>)和低剂量组(0.1mg/m<'3>)，臭氧暴露设高剂量组(0.50mg/m<'3>)和低剂量组(0.16mg/m<'3>)，每个剂量设立1h、8h两个时间剂量点，同时低剂量暴露组加入抗氧化保护剂NAC，构成平行NAC保护组。每个剂量组设3个平行样，气液界面培养皿共45皿。 备注：(AF：过滤空气，O<,3> 臭氧，FA 甲醛)3、观察指标细胞形态学改变，BEAS-2B细胞毒性试验，细胞内氧化型和还原型谷胱甘肽含量的比值，细胞一氧化氮合成酶和超氧化物歧化酶活性；细胞培养上清中白介素．2和一氧化氮的含量。 结果 1、运用petri-PERM培养皿建立的气态污染物毒性体外暴露系统是有效的，倒置显微镜下发现对照组和实验组细胞形态学存在明显差异，臭氧和甲醛低剂量8小时暴露组和高剂量暴露组的支气管上皮细胞脱落，死亡细胞数明显增加，细胞变小变圆，存在团块状的死细胞团。 NAC保护组的支气管上皮细胞没有明显的形态学改变。 2、细胞毒性试验结果2.1 台盼兰毒性实验臭氧和甲醛暴露组均可见支气管上皮细胞的死亡细胞数随着剂量的增加而增加，随着染毒时间的延长而增加，同时低剂量组加入抗氧化剂NAC后，死亡细胞数明显减少。 2.2 CCK-8细胞增殖毒性试验细胞活力随着臭氧和甲醛染毒剂量和时间的增加而下降，同时加入NAC后细胞活力均升高，提示臭氧对支气管上皮细胞的毒性有一定的时间效应和剂量效应关系。 3、细胞内GSH/GSSG结果低剂量臭氧可以使细胞内的GSH/GSSG下降，高剂量臭氧也可以使支气管上皮细胞内GSH/GSSG下降，且下降的幅度要明显高于低剂量组，8小时臭氧暴露组细胞内GSH/GSSG低于1小时暴露组。低剂量甲醛可以使细胞内的GSH/GSSG下降，高剂量甲醛也可以使支气管上皮细胞内GSH/GSSG下降，且下降的幅度要明显高于低剂量组。8小时臭氧暴露组细胞内GSH/GSSG低于1小时暴露组；8小时甲醛暴露组细胞内GSH/GSSG低于1小时暴露组。NAC保护的1小时和8小时臭氧暴露组细胞内GSH/UGSSG均高于未加NAC的臭氧暴露组，NAC保护的1小时和8小时甲醛暴露组细胞内GSH/GSSG均高于未加NAC的甲醛暴露组。 4、酶活性结果低剂量和高剂量臭氧暴露组支气管上皮细胞SOD活性均明显高于对照组，但是高剂量臭氧暴露组细胞SOD活性低于低剂量组。1小时臭氧暴露组支气管上皮细胞SOD活性低于同剂量8小时组。低剂量和高剂量甲醛暴露组支气管上皮细胞SOD活性均明显高于对照组，但是高剂量甲醛暴露组细胞SOD活性低于低剂量组。1小时甲醛暴露组支气管上皮细胞SOD活性低于同剂量8小时组。NAC保护的1小时和8小时臭氧暴露组细胞SOD活性均低于未加NAC的臭氧暴露组，NAC保护的1小时和8小时甲醛暴露组细胞SOD活性均低于未加NAC的甲醛暴露组。 低剂量臭氧暴露组支气管上皮细胞NOS活性显著高于对照组，但是高剂臭氧暴露组支气管上皮细胞NOS活性却低于对照组。低剂量臭氧暴露8小时组支气管上皮细胞NOS活性要高于1小时组。低剂量甲醛暴露组支气管上皮细胞NOS活性显著高于对照组，但是高剂量甲醛暴露组支气管上皮细胞NOS活性低于对照组。低剂量甲醛暴露8小时组支气管上皮细胞NOS活性要高于1小时组。NAC保护的1小时和8小时臭氧暴露组细胞NOS活性均低于未加NAC的臭氧暴露组，NAC保护的1小时和8小时甲醛暴露组细胞NOS活性均低于未加NAC的甲醛暴露组。 5、培养上清中NO检测结果低剂量臭氧和甲醛暴露组均高于对照组，但是低剂量臭氧暴露组要高于高剂量组，差异有统计学意义。臭氧和甲醛低剂量1小时组要高于8小时组，低剂量的暴露下表现一定的时间效应关系。高剂量甲醛暴露组1小时和8小时与对照组相比没有差异。高剂量臭氧暴露组1小时和8小时稍高于对照组，差异具有统计学意义，但是高剂量组低于低剂量组。低剂量NAC保护组1小时和8小时组均低于未加NAC低剂量臭氧和甲醛暴露组，差异具有统计学意义。 6、细胞培养上清中IL-2浓度低剂量臭氧暴露组细胞培养上清中IL-2浓度高于对照组和高剂量组，低剂量甲醛暴露组细胞培养上清中IL-2浓度高于对照组和高剂量组。高剂量臭氧暴露1小时组细胞培养上清中IL-2浓度高于对照组，但是8小时组与对照组没有差异；高剂量甲醛暴露1和8小时组细胞培养上清中IL-2浓度与对照组相比没有差异。低剂量臭氧或甲醛的NAC保护组1小时和8小时组均低于未加NAC低剂量臭氧暴露组。 结论 1、应用petri-PERM培养皿建立的气态污染物体外暴露系统，可以成功暴露支气管上皮细胞于甲醛和臭氧，该系统可以用于气态污染物的体外毒效应研究。 2、抗氧化保护剂N-乙酰基半胱氨酸可以抑制低剂量臭氧和甲醛对支气管上皮细胞的氧化损伤和炎症介质释放，说明臭氧和甲醛对支气管上皮细胞的氧化损伤确实存在；也提示支气管上皮细胞内氧化还原状态的改变可能诱导支气管上皮细胞合成炎症介质并参与气道炎症的启动。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章材料与方法

第三章结果

附图:各实验组细胞培养图片

第四章讨论

第五章结论

参考文献

缩写词汇中英文对照表

致谢

原创性声明