大环内酯类抗生素的免疫调节作用及其对实验性自身反应性脑脊髓炎的影响

摘要

大环内酯类抗生素是一类具有12-22个碳内酯环化学结构的快速抑菌剂，主要用于革兰氏阳性细菌，对衣原体、支原体、军团菌以及螺旋杆菌也有较强的抑制作用。近年来的研究发现，大环内酯类抗生素不仅具有抗感染作用，还具有非抗菌的免疫调节作用，可以抑制中性粒细胞的移位、聚集，促进中性粒细胞的凋亡，抑制促炎性细胞因子、黏附分子、基质金属蛋白酶等的表达，抑制淋巴细胞的增殖，诱导淋巴细胞的凋亡，抑制树突状细胞的成熟等。目前已经在临床上用于治疗弥漫性泛支气管炎(diffuse panbronchiolitis)、哮喘、类风湿性关节炎、鼻窦炎、鼻息肉等疾病的治疗，并取得了肯定的效果。 多发性硬化是中枢神经系统炎症性自身免疫性疾病。目前，病因及发病机制不清，普遍认为是MS在易感基因的基础上由环境因素所诱发的自身免疫性炎性脱髓鞘疾病。感染是诱发多发性硬化的重要环境因素。既往的研究主要集中于病毒感染和多发性硬化的关系，但近年来发现肺炎衣原体感染与MS发病有密切关系，甚至有人认为MS可能是肺炎衣原体感染引起的综合征。临床应用大环内酯类抗生素长疗程治疗合并肺炎衣原体感染的多发性硬化，有效减少了病灶大小、钆增强病灶的数目以及脑实质萎缩。 本研究首先在体外实验中观察了大环内酯类抗生素对EAE鼠脾细胞凋亡和增殖的影响，在此基础上给Lewis鼠应用大环内酯类抗生素，并诱导建立EAE模型，以观察大环内酯类抗生素对EAE的影响，探讨大环内酯类抗生素对未合并肺炎衣原体感染多发性硬化的影响，以便为如何在多发性硬化患者中应用大环内酯类抗生素提供依据。 本课题研究内容包括两部分： 第一部分：大环内酯类抗生素对脾细胞凋亡和增殖的作用； 第二部分：大环内酯类抗生素对树突状细胞分化、成熟的影响； 第三部分：大环内酯类抗生素的免疫调节作用对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响。 第一部分：大环内酯类抗生素对脾细胞凋亡和增殖的作用 目的：探讨大环内酯类抗生素对培养脾细胞凋亡和增殖的作用，以阐明大环内酯类抗生素在免疫调节中的作用。 方法：从髓鞘碱性蛋白肽段68-86(MBP68-86)诱导的实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE) Lewis大鼠中获得脾细胞，然后在MBP68-86和重组大鼠白细胞介素—2(rRIL—2)的共同刺激下进行培养。根据干预方法的不同，把培养的脾细胞分为control组、阿齐霉素组(AM)以及克拉霉素组(CM)。在脾细胞的培养体系中加入不同浓度的阿齐霉素和克拉霉素，首先用Annexin V测定凋亡试剂盒对在低浓度(≤10μ g/ml) AM和CM中培养的脾细胞进行染色，然后应用流式细胞仪测定细胞凋亡。在此基础上，观察10μg/ml AM和CM对增殖的作用，在10μg/ml AM和CM中培养脾细胞24小时，在培养结束前6小时，加入3H—TdR，应用β闪烁仪测定3H—TdR的掺入率，以了解AM和CM对脾细胞增殖的作用。此外，还观察了高浓度(100μ g/ml) AM和CM对脾细胞凋亡的影响。 结果：脾细胞在低浓度(≤10μg/ml) AM和CM中培养24小时，分别有30-40％和20-30％的发生早期凋亡，有20-30％细胞为Annexin V和PI双阳性，与control组相比没有显著性差异(P>0.05)，但是10μg/ml的AM和CM可抑制脾细胞的增殖，抑制率达30％左右。高浓度(100μg/ml) AM和CM分别可诱导约16.9％和23％的脾细胞发生早期凋亡，74.2％和59.9％的脾细胞为Annexin V及PI双阳性，显著高于control组。 结论：大环内酯类抗生素AM和CM，在低浓度时可抑制特异性抗原和IL—2刺激下培养的脾细胞增殖，而在高浓度时可促进特异性抗原和IL—2刺激下培养的脾细胞凋亡。大环内酯类抗生素的免疫调节作用可能与其诱导淋巴细胞凋亡和抑制淋巴细胞增殖有关。 第二部分：大环内酯类抗生素对树突状细胞的影响 目的：探讨大环内酯类抗生素对树突状细胞表达共刺激分子的影响 方法：在细胞因子GM—CSF以及IL—4联合的作用下，把大鼠骨髓细胞诱导成树突状细胞，然后测定细胞表达OX62、共刺激分子的水平，同时进行形态学观察，对细胞进行鉴定。在鉴定细胞为树突状细胞后，在树突状细胞的培养体系中加入大环内酯类抗生素，然后应用脂多糖诱导细胞成熟，观察细胞表达共刺激分子的水平。 结果：在GM—CSF以及IL—4的共同作用下，大鼠骨髓细胞经过6-7天可发育为树突状细胞，OX62表达率达50％左右，Giemsa染色有明显的细胞突起。在未诱导树突状细胞成熟之前，其低表达共刺激分子，诱导成熟后，共刺激分子表达水平增高。在诱导成熟之前，加入大环内酯类抗生素可抑制树突状细胞表达共刺激分子。 结论：在GM—CSF和IL—4联合作用下，可诱导骨髓细胞分化为树突状细胞。不成熟树突状细胞低表达共刺激分子，诱导成熟后表达共刺激分子的水平增高。在诱导树突状细胞成熟之前，加用大环内酯类抗生素可抑制树突状细胞表达共刺激分子，以CD86较明显。 第三部分：大环内酯类抗生素对实验性自身反应性脑脊髓炎的影响 目的：探讨大环内酯类抗生素对实验性自身反应性脑脊髓炎的影响及其机制。 方法：15只Lewis大鼠随机分为control组、AM组和CM组，每组5只动物。在应用MBP68-86诱导Lewis大鼠建立实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE)模型之前2天起，每天分别给予CMC、AM和CM灌胃。诱导EAE模型后，每天称量动物的体重、进行临床评分。在诱导动物发病前、发病第三天以及病情完全缓解后，尾静脉取血，收集血清和外周血细胞，应用ELISA法测定外周血中细胞因子白介素10、干扰素γ(IFN—γ)，应用流式细胞仪测定外周血中CD4CD25细胞变化，应用硝酸盐还原法测定一氧化氮(NO)水平变化。在动物发病第三天，麻醉处死后取脊髓，收集单个核细胞测定其凋亡率，提取蛋白质测定各组诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的水平。在动物发病完全缓解后，取脑和脊髓进行HE染色和髓鞘染色。 结果：所有大鼠在免疫诱导后第10天发病，其中CONTROL组平均发病时间为10.6天，AM和CM组为10.4天，CONTROL组平均最重病情(4.0分)较其他两组(4.8分)低。脑和脊髓切片HE染色有炎症细胞浸润，髓鞘染色有髓鞘脱失。外周血IL-10以及IFN—γ水平各组之间没有明显差异，Control组NO水平较其他两组增高，脊髓内iNOS水平也较AM和CM组高。在动物发病高峰期，外周血CD4+CD25+/CD4+细胞增加，其中以CM组增加较明显。三组中脊髓内Annexin V阳性细胞没有显著差异。 结论：(1)应用MBP68-86诱导Lewis大鼠，可建立典型的炎症性脱髓鞘的动物模型。(2) Lewis大鼠诱导发生EAE时，体内CD4+CD25+/CD4+呈现一过性下降，随着病情的缓解又恢复到发病前的水平。(3) AM和CM可使EAE动物的病情加重，其可能机制是通过抑制iNOS的表达，而使体内NO水平下降。(4) AM和CM不影响IL-10和IFN—γ表达，也不诱导脊髓内Annexin V阳性细胞增多，CM可诱导外周血中CD4+CD25+/CD4+增高。

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论文说明：主要英文缩略词表

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引言

第一部分 大环内酯类抗生素对脾细胞凋亡和增殖的影响

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4结论

1.5参考文献

第二部分 大环内酯类抗生素对树突状细胞的影响

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

2.5参考文献

第三部分 大环内酯类抗生素对实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论：

2.4结论：

2.5参考文献

结束语

综述：T细胞受体疫苗治疗多发性硬化的研究现状

攻读学位期间发表的论文

致谢