聚乙二醇-壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其基因传递系统性能的研究

摘要

聚合物类基因传递载体目前受到了越来越广泛的关注，很多学者认为它是一种有希望替代病毒类基因载体进入基因治疗领域的载体。与病毒类载体相比，聚合物类基因传递载体具有低免疫原性、可携带较大的DNA片段、储存稳定、适于大批量生产。通过对聚合物进行各种修饰改性或结合配基，可适用于多种给药方式或靶向给药。 壳聚糖(Chitosan，CS)作为非病毒类基因载体的研究目前已日趋成熟。作为一种天然的高分子多糖材料，无论是在体外还是体内的应用研究，壳聚糖都具有其他阳离子类聚合物载体所无法比拟的低毒性和高度生物相容性。壳聚糖的转染效率与许多因素有关，包括壳聚糖自身的分子量和脱乙酰度、环境的pH值和细胞类型等。但总体来讲，壳聚糖的转染效率不够高。此外，壳聚糖的特殊分子结构使得它在中性或生理pH值环境中的溶解性较差。为了提高壳聚糖载体的转染率，可将壳聚糖进行水溶性改性，增强壳聚糖与DNA的结合和在生理条件下的稳定性；或接入配体，增加壳聚糖载体与靶向细胞的亲和性。 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是常用的生物相容性材料，它不仅能改善其他高分子的水溶性，也能通过对纳米粒的表面修饰改善其体内分布。聚乙二醇是高度亲水的柔性链，可结合大量的水分子，形成一层水性的外壳，将纳米粒“隐藏”在内，避免被网状内皮系统和巨噬细胞识别，增加在血液系统中的循环时间，因而又有“隐形纳米粒”和“长循环纳米粒”的美称。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究最广泛而高效的基因传递载体。PEI含有大量的氨基，在溶液中携带高密度的正电荷，能与DNA形成紧密的纳米复合物，易被细胞内吞。进入细胞后，PEI又能通过质子海绵作用迅速突破内涵体，将DNA释放出来。尽管PEI有诸多的优点，但细胞毒性是其应用中的一大障碍。 目前对壳聚糖类基因载体的研究多限于报告基因和基因传递系统的动物体内分布的研究，距离真正的疾病临床应用还有较长的距离。 本研究以CS为主体，接枝PEG和PEI，合成了一种新型的基因传递载体PEG-CS-PEI。这种新载体可将CS、PEG和PEI三者的优点相结合并避免各自的缺点。新载体PEG-CS-PEI与常用的PEI 25K载体对模型细胞HeLa具有不同毒性机制；利用绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因，两者具有不同的转染行为。体内试验是利用已有三十多年历史的较为成熟的动脉内皮损伤模型，及已获得广泛公认的血管内皮生长因子(VEGF)作为治疗基因，研究PEG-CS-PEI／VEGF基因传递系统在动物体内的有效性。 1聚乙二醇-壳聚糖共聚物的合成与结构表征将分子量5 000的单甲氧醚聚乙二醇的端羟基氧化为醛基，在酸性水溶液中与壳聚糖的氨基生成西弗碱；再用氰硼氢化钠还原西弗碱，得到聚乙二醇-壳聚糖接枝共聚物。分别用IR和1HNMR表征了中间产物和共聚物。调整投料比得到不同PEG取代度的共聚物分子，XRD和DSC研究其热行为和结晶行为，发现随着PEG取代度的增高，共聚物分子逐渐表现为与PEG类似的结晶性。 2聚乙二醇-壳聚糖共聚物与DNA的结合试验：筛选最佳PEG接枝率的共聚物动态光散射法测定结果证实，接枝PEG后，CS仍能与DNA通过静电相互作用形成纳米级的复合物微球。PEG取代度对复合物纳米球尺寸的影响不大，通常都在200nm左右。琼脂糖凝胶电泳和zeta电位测定结果证实，聚乙二醇．壳聚糖共聚物能够屏蔽或中和DNA的负电荷，阻止DNA分子向电场的正极泳动。共聚物与DNA的结合过程收到PEG取代度的影响，不同PEG取代度的共聚物分子表现出不同的DNA结合行为。壳聚糖氨基与DNA磷酸基的数目比(N／P比)是重要的复合物参数。N／P比的增高，意味着在聚合物与DNA形成的复合物中，阳离子聚合物含量的增加。试验结果证明，PEG取代度为3.55％的PEG(3.55)-CS(50K)共聚物分子具有最佳的DNA结合能力，具体体现在PEG(3.55)-CS(50K)能完全结合DNA时所需的聚合物最少(最低阻滞N／P比即LRR值最小)；中和DNA负电荷最多最快(zeta电位曲线上升最快，值最大)。而较低的PEG取代度对CS结晶结构的破坏不够，不能使CS链充分伸展；较高的PEG取代度则由于较多PEG分子的存在而带来空间位阻，影响CS与DNA的结合。 3聚乙二醇-壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物(PCP)的合成与结构表征由于PEG-CS的转染率不理想，为提高载体转染率，设想将PEI接枝到CS链上。首先合成了PEI的单体-氮丙啶，然后在PEG-CS的水溶液中进行氮丙啶的阳离子聚合反应，有一部分氮丙啶单体随机碰撞到CS链上的氨基并从CS的氨基上长成PEI链段，从而实现PEI与CS的结合。PEG-CS-PEI共聚物的结构通过1HNMR、13CNMR和GPC进行了表征。根据1HNMR谱图的峰面积计算每分子CS所接枝PEI的总分子量；共聚物的GPC曲线为一单峰，分子量大于CS和PEG-CS，表明产物为共聚物。 4 PCP共聚物细胞毒性机制的探讨采用MTT法初步测定了PCP共聚物的细胞毒性，并与PEG-CS共聚物和PEI 25K进行了比较。结果显示，PCP的细胞毒性与浓度呈正相关性。总体来讲，PCP共聚物比PEG-CS共聚物的细胞毒性大，提示其毒性主要来自所含的PEI链段。而与PEI 25K相比，PCP共聚物的毒性小，在低浓度时则更为显著。光镜观察聚合物的细胞毒性作用时，发现不同聚合物对细胞形态的影响不同。与PEI25K共培养的细胞，在0.5h后即出现了大面积的细胞剧烈收缩和破裂现象；而与PCP共培养的细胞，在较长时间后出现局部细胞皱缩的现象。通过细胞生物学科常用的Annexin V-PI双染色法和流式细胞仪检测，发现PEI 25K导致了大量培养细胞的坏死，而PCP诱导的细胞坏死率则低得多，另有一部分细胞通过凋亡途径死亡，大大减少了对周围细胞的破坏，具有良好的体内应用前景。 5PCP共聚物／pEGFP的体外细胞转染试验结合PEI后的PCP载体，与质粒结合的最低阻滞N／P比(LRR)比原料PEG(3.55)-CS(50K)并没有明显增高，仍在N／P比6左右。但所形成复合物的粒径由原来的200nm左右减小到约50个纳米，说明PCP共聚物对DNA结合能力的提高。以绿色荧光蛋白基因(pEGFP)为报告基因，重点考察了PCP载体的最佳转染条件和最大转染效率，并与PEG-CS和PEI 25K进行了比较。结果显示，PCP载体的转染率随转染时间的增加而增高，当转染时间达到48h时，转染率达到了30％，十倍于PEG-CS的转染率。PCP载体在含10％血清培养液中的转染率高于不含血清培养液中的转染率，说明PCP载体保持了CS骨架的优点。 6 PCP载体介导VEGF基因表达的体外和体内研究对培养细胞的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测和细胞培养上清液的ELISA检测，证实PCP载体介导了携VEGF基因的质粒EGFP-VEGF进入细胞并表达VEGF mRNA和VEGF蛋白。动物实验是利用球囊损伤兔颈动脉内皮模型，局部保留灌注给予PCP／pEGFP-VEGF基因传递系统，观察两周后血管内膜的新生内皮形成情况。HE染色切片和电镜图片表明该基因传递系统具有促进受损内皮修复、抑制内膜增生和管腔变窄的作用，证实PCP载体具有递送基因、实现目的蛋白的表达并在体内发挥所需生物学功能的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词

声明

第一章前言

1.1非病毒载体的优势

1.1.1非病毒传递的有效性

1.1.2非病毒载体的组织特异性

1.1.3非病毒载体具有持续性的基因表达

1.1.4非病毒载体的安全性

1.2基因传递过程中的屏障及解决方法

1.2.1第一步：载体到达靶细胞的途径

1.2.2第二步：将外源基因转入胞浆

1.2.3第三步：基因入核

1.3 PEI与壳聚糖作为基因载体的应用

1.3.1影响转染效率的因素

1.3.2聚乙二醇修饰基因载体

1.3.3用于靶向给药的特异配体修饰

1.3.4聚合物基因载体的体内应用

1.4基因治疗在防治经皮冠脉成形术(PTCA)术后再狭窄(RS)中的作用

1.5课题的提出

第二章聚乙二醇-壳聚糖共聚物的合成与表征

2.1试剂

2.2合成实验方法

2.2.1 mPEG端羟基的醛化

2.2.2 mPEG-g-CS的合成

2.3结构表征

2.4结果与讨论

2.4.1 mPEG的ω-OH的醛化及mPEG-CHO的结构表征

2.4.2 mPEG-graft-CS的合成及表征

2.5本章小结

第三章PEG-CS聚合物与质粒DNA的结合试验：最佳PEG接枝率的筛选

3.1材料和仪器

3.2实验方法

3.2.1 LB液体培养基的配制

3.2.2质粒pEGFP-C1的小量制备(按照试剂盒说明书进行)

3.2.3聚合物PEG-CS/质粒pEGFP复合物的制备

3.2.4聚合物PEG-CS/质粒vpEGFP复合物的凝胶电泳阻滞试验

3.2.5聚合物PEG-CS/质粒pEGFP复合物的粒径和Zeta电位测定

3.3结果与讨论

3.3.1 PEG-CS/DNA凝胶电泳阻滞试验

3.3.2 PEG-CS/DNA复合物的粒径分析

3.3.3 PEG-CS/DNA复合物的Zeta电位

3.4本章小结

第四章聚乙二醇-壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物的合成

4.1试剂

4.2实验方法

4.2.1氮丙啶的合成

4.2.2阳离子聚合法合成PEG-CS-PEI

4.2.3 PEG-CS-PEI聚合物的结构表征

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章聚合物的细胞毒性试验及其机制的探讨

5.1材料和仪器

5.2实验方法

5.2.1 HeLa细胞培养

5.2.2聚合物储备液的配制

5.2.3 MTT比色法测细胞活力

5.2.4细胞形态观察

5.2.5细胞调亡或坏死率测定

5.3结果与讨论

5.3.1细胞的选择

5.3.2聚合物储备液的配制

5.3.2 MTT比色法测细胞活力

5.3.3细胞形态观察

5.3.4 HeLa细胞的调亡或坏死率

5.4本章小结

第六章PEG-CS-PEI/pEGFP复合物的细胞转染试验

6.1材料和仪器

6.2实验方法

6.2.1质粒pEGFP的大量制备

6.2.2聚合物/质粒pEGFP复合物的制备及性能分析

6.2.3 PCP/DNA复合物的细胞转染试验及其影响因素

6.3结果

6.3.1 PCP与质粒DNA结合能力及纳米复合物的性能研究

6.3.2 PCP/DNA复合物的转染效率

6.4本章小结

第七章PEG-CS-PEI/pEGFP-VEGF165基因传递系统的细胞转染试验

7.1材料和仪器

7.2实验方法

7.2.1RT-PCR检测转染PCP/pEGFP-VEGF后HeLa细胞中VEGFmRNA的表达

7.2.2 ELISA检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达

7.3结果

7.3.1 RT-PCR检测VEGF mRNA表达的结果

7.3.2 ELISA检测结果细胞培养上清液中VEGF蛋白表达的结果

7.4本章小结

第八章PEG-CS-PEI/pEGFP-VEGF165基因传递系统防治兔颈动脉术后再狭窄的研究

8.1材料和仪器

8.2实验方法

8.2.1实验动物的喂养

8.2.2兔颈动脉内皮损伤模型的建立

8.2.3基因治疗给药方法

8.2.4扫描电子显微镜观察

8.2.5血管切片的组织学和图像分析

8.3结果

8.3.1兔颈动脉损伤后血管内膜及形态学的改变

8.3.2血管新生内皮面积的变化

8.4讨论

8.5本章小结

结论

本研究的特色和创新之处

攻读博士学位期间发表的论文

参考文献

致谢