他汀类药物抑制脑血管平滑肌细胞增殖及其与容积调节性氯通道的关系

摘要

脑卒中是最常见的脑血管疾病，是人类死亡的三大因素之一。已经确认高血压是导致脑卒中的重要危险因素之一。高血压发展过程中出现的血管重构是引起脑卒中、心肌梗死等高血压并发症的病理基础，形态学上主要表现为管径变细、管壁增厚。其中平滑肌细胞的增殖被经典地认为是脑血管重构的重要因素，有研究显示在高血压过程中，VSMC复制增加而相应的细胞凋亡没有增加，从而导致动脉和小动脉中膜层的增厚。 他汀类药物，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，体内实验已经证明他汀类药物具有“多效性”的作用，包括改善内皮功能、抗氧化、增加NO合成、降低炎症和平滑肌细胞增殖。这些效应的作用机制可能与胆固醇合成的重要中间产物FPP和GGPP有关，这些类异戊二烯分子作为脂性基团与转录后的一些信号蛋白分子如Ras，Rho共价结合后使之活化，从而激活其下游信号分子。许多研究表明活化的Rho蛋白参与了血管的许多重要的生理和病理过程，包括平滑肌收缩、细胞增殖、迁移和炎症反应。然而他汀类药物抑制增殖的机制还不十分清楚。 本课题在原代培养的大鼠基底动脉平滑肌细胞上观察simvastatin对ET-1和低渗培养基诱导平滑肌细胞增殖的抑制作用及其与VRCC的关系。 第1章simvastatin对ET-1和低渗培养基诱导的平滑肌细胞增殖的影响 采用CCK-8和BrdU掺入实验及细胞记数法检测simvastatin对ET-1和低渗培养基诱导平滑肌细胞增殖的作用及其调节机制。结果表明： 1.10-8MET-1可引起BASMCs增殖，用CCK-8法检测在450nm处的吸光度反应细胞活力，三组与对照相比都有显著性差异。在48小时时间点ET-1增殖率最高。 2.25％低渗培养基孵育BASMCs3h，6h，12h，24h，48h，50％低渗培养基孵育BASMCs12h后用CCK-8法检测细胞活力，25％低渗培养基孵育6h，12h，24h后的细胞活力都与对照组有显著性差异，并以24h作用为最好。25％低渗培养基作用48h，50％低渗培养基作用12h反而使细胞活力比对照降低。 3.simvastatin浓度依赖性的抑制10-8MET-1诱导的BASMCs的增殖。 4.simvastatin浓度依赖性的抑制低渗培养基诱导的BASMCs的增殖，以对照组为100％，则BrdU掺入实验显示低渗培养基处理组。 5.20μMsimvastatin完全抑制10-8MET-1诱导的BASMCs的增殖。在培养基中同时加入100μM甲羟戊酸，10μMGGPP可以完全逆转simvastatin的作用。10μMFPP只能部分逆转simvastatin的作用，增殖百分数为110.2±3.7％，与单独ET-1处理组和对照组之间都有显著性差异。 6.20μMsimvastatin完全抑制25％低渗培养基诱导的BASMCs的增殖。在培养基中同时加入100μM甲羟戊酸，10μMGGPP可以完全逆转simvastatin的作用。10μMFPP只能部分逆转simvastatin的作用，与对照组之间没有显著性差异。 小结： 1.10-8MET-1和25％低渗培养基都可以诱导BASMCs增殖。 2.simvastatin可以浓度依赖性地抑制10-8MET-1和25％低渗培养基诱导的BASMCs增殖。 3.simvastatin的抑制效应可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆转，10μMFPP只能部分逆转此效应。100μM胆固醇完全不能逆转simvastatin的效应。0.25μg/mlC3和10μMY-27632可以模拟simvastatin的效应。 第2章simvastatin对容积调节性氯通道的作用及其调节机制 采用单细胞荧光影像分析系统和膜片钳技术分析simvastatin对VRCC的影响及其调节机制。结果表明： 1.细胞外灌流液由310mosmol/kg·H2O转换为230mosmol/kg·H2O低渗溶液后，可引起BASMCs细胞内氯离子的外流，经校正后等渗和低渗细胞内氯离子浓度分别为31.0±1.3mM和21.8±1.4mM，细胞内氯离子降低比率为29.6±4.6％. 2.simvastatin浓度依赖性地抑制低渗诱导的氯离子的外流。simvastatin2.5，5，10，20μM等渗预敷细胞5分钟后，换成低渗细胞外液灌流细胞。 3.细胞外灌流液中预先加入100μMMVA或10μMGGPP，5分钟后再加入20μMsimvastatin可以完全阻断simvastatin抑制氯离子外流的作用，与对照组低渗情况下胞内氯离子浓度无显著性差异。10μMFPP只能部分阻止simvastatin的效应，低渗细胞内氯离子浓度为26.3±0.7mM，与对照组和simvastatin组低渗情况下胞内氯离子浓度相比都有显著性差异。 4.0.25μg/mlC3预孵细胞4小时后，BASMCs由等渗换成低渗溶液灌流。 5.细胞外低渗溶液刺激下，BASMCs胞浆氯离子浓度从静息时的31.7±2.5mM降低到21.0±1.5mM，接着应用10μMY-27632能部分抑制低渗诱发的氯离子外流，抑制率为20.1±6.9％。 6.在等渗细胞外液中直接加入ET-1不能直接激活氯离子的外流。10-8MET-1孵育细胞48小时后，灌注低渗溶液。 7.低渗溶液引起BASMCs明显肿胀，随后激活一氯离子依赖性外向整流电流。该电流在正电位时缓慢失活。在胞内外氯离子浓度相等条件下其反转电位接近氯离子平衡电位。 8.simvastatin浓度依赖性地抑制Icl,vol，20μMsimvastatin预孵细胞5分钟达到最大抑制效应。该抑制效应没有电压依赖性。 9.100μMMVA和10μMGGPP预孵细胞可完全逆转simvastatin的抑制Icl，vol效应。 10.电极内液孵育10μMY-27632显著降低低渗激活的Icl,vol。抑制效应没有电压依赖性。 小结： 1.在BASMCs上单细胞测细胞内氯离子浓度和膜片钳技术都显示simvastatin能浓度依赖性地抑制低渗诱导的氯离子外流和Icl,vol。 2.simvastatin的抑制效应可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆转，10μMFPP只能部分逆转此效应。 3.0.25μg/mlC3预孵细胞4小时可明显减低低渗诱导的氯离子外流，而低渗诱导VRCC开放后再给予10μMY-27632仅微弱抑制氯离子外流。 4.10μMY-27632电极内液给药，能模拟simvastatin的效应，抑制低渗细胞外液诱导的Icl,vol。 5.等渗情况下直接应用ET-1不能激活胞内氯离子的外流，而当ET-1预孵细胞48h后，在给予低渗细胞外液的情况下，可以加大氯离子外流的幅度。 第3部分VRCC在simvastatin抑制BASMCs增殖中的作用 通过在BASMCs上转染豚鼠心室肌ClC-3cDNA全长，采用BrdU掺入实验观察ClC-3对simvastatin抑制细胞增殖的影响。并且通过simvastatin抑制增殖和抑制氯运动IC50值以及相关性的分析，阐述两者之间的相互作用。结果如下： 1.BASMCs转染CIC-3cDNA后，10-8MET-1诱导的增殖率由未转染的129.5±3.0％增加到143.7±2.7％，两者之间有显著性差异。 2.simvastatin能浓度依赖性地抑制10μMET-1和25％低渗培养基诱导的转染CIC-3BASMCs的增殖，但抑制率较未转染细胞明显降低。 3.simvastatin抑制10-8MET-1和25％低渗培养基诱导的未转染ClC-3BASMCs增殖的IC50值分别为3.2±0.04和3.4±0.50M，而转染ClC-3后的IC50值分别为5.3±0.7和5.6±0.7μM，两者之间有显著性差异。 4.simvastatin抑制氯离子外流的IC50值为3.7±0.2μM，与其抑制细胞增殖的IC50值相近。 5.对simvastatin抑制10-8MET-1诱导的细胞增殖和抑制低渗诱导的氯离子外流之间进行相关性分析，发现两者成正相关，相关系数为0.94。simvastatin抑制25％低渗培养基诱导的细胞增殖和抑制低渗诱导的氯离子外流之间也呈正相关，相关系数为0.84。 小结： 1.转染ClC-3后simvastatin对10-8MET-1和25％低渗培养基诱导的增殖的抑制作用减弱。量效曲线右移。 2.simvastatin抑制氯离子外流和抑制增殖的IC50值相近，且之间有强的正相关性。 结论： 1.Simvastatin能浓度依赖性地抑制ET-1或低渗溶液诱导的BASMCs的增殖。Simvastatin抑制增殖的效应是由MVA-GGPP-Rho信号通路介导的。 2.Simvastatin能浓度依赖性地抑制低渗诱导的VRCC的开放。Simvastatin对VRCC的调节也由MVA-GGPP-Rho信号通路介导。 3.Simvastatin对细胞增殖的抑制作用是由VRCC介导的，过表达ClC-3蛋白降低simvastatin的抑制增殖效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写对照表

声明

前言

第一部分simvastatin对ET-1和低渗培养基诱导的平滑肌细胞增殖的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分simvastatin对容积调节性氯通道的作用及其调节机制

材料与方法

结果

讨论

小 结

第三部分VRCC在simvastatin抑制BASMCs增殖中的作用

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

创新与意义

附表

附图

参考文献

致谢