SV40大T抗原体外永生化视神经胶质瘤细胞及其生物学特性的研究

摘要

胶质瘤是颅内最为多见的恶性肿瘤。发病率占全身所有肿瘤的1-3％，占颅内肿瘤的35-60％，占小儿脑肿瘤40-65％1,2。视神经胶质瘤(Optic Nerve Glioma，ONG)较为罕见，发病率为1／10万，国外报道其占儿童颅内肿瘤的2-5％，国内报道在1％左右3，占眶内肿瘤的6％4。目前的文献报道认为，90％以上的ONG为低级别的星形胶质细胞瘤，按WH0标准5均为星形细胞瘤Ⅰ-Ⅱ级，其间可混有星形细胞或极少散在的星形细胞6。胶质瘤目前的治疗方法虽多7-9，但从临床疗效看，结果不尽如人意，特别是儿童患者10。由于病因不清，无法进行预防和彻底根治，故胶质瘤的治疗仍是一个世界性的难题。目前ONG原代培养的细胞性质和特点上更接近于肿瘤在人体原始状态细胞，为人类研究肿瘤的发生发展机制、生长浸润特性等提供了最佳的手段。常规的肿瘤细胞原代培养有两种方法，一种是组织块法，另一种是酶消化法。由于原代培养的视神经胶质瘤传代次数有限，制约了进一步的研究。在本世纪初，美国学者Rous发现了世界上第一个肿瘤病毒(Rotlssarcomavios，Rsv)后，就将病毒与肿瘤的发生联系起来11。猿病毒40(Simian Virus40，SV40)是小DNA病毒，有研究显示：SV40在体外可以使人和动物的正常细胞发生恶性转化，生长活性增强，进而建立细胞株12。本研究旨在探讨SV40转染正常的人视神经胶质细胞瘤，在永生化视神经胶质瘤中的作用。 一、研究目的： 病例诊断视神经胶质细胞瘤一例，组织块法原代培养的视神经胶质瘤细胞，传代后以SV40大T抗原将其永生化，拟建立视神经胶质瘤细胞系，并进一步研究其生物学特性。 二、研究方法： 1、病例报告：中山大学眼科医院手术室切除的肿瘤标本一例，用福尔马林固定，石蜡包埋后切片，HE染色；免疫组织化学GFAP，VIM染色，光学显微镜镜下观察。 2、同一例视神经胶质瘤，从中山大学眼科医院手术室无菌取出带到实验室，组织块培养法体外培养视神经胶质瘤细胞，并传代十代，应用倒置显微镜和MTT比色法观察瘤细胞的生长增殖情况，用免疫组织化学染色，扫描和透射电镜对瘤细胞进行鉴定。 3、采用Lipofectomin2000法，将携带SV40大T抗原的质粒tgLS(+)LoxPhyTK-cmvLT转染入传代培养至第十代的视神经胶质瘤细胞，Hygromycin B进行克隆筛选，并反复传代培养；MTT比色法观察瘤细胞增值情况；细胞克隆实验观察瘤细胞的克隆形成能力；透射电镜、免疫组织化学、RT-PCR进行鉴定。 4、将转染后的视神经胶质瘤细胞和人黑色素瘤细胞OCM-1在三维培养基(3D-Culture)中进行培养，HE染色形态学观察。用RT-PCR检测血管内皮相关基因，以人黑瘤细胞株OCM-1做阳性对照，人视网膜色素上皮细胞株D-407为阴性对照。 5、将转染后的视神经胶质瘤细胞放入无血清的限制分化培养基中，倒置显微镜下观察，用免疫组化、免疫荧光以及RT-PCR做鉴定。 三、研究结果： 1、对肿瘤标本的的HE染色和免疫组织化学染色观察，确诊为视神经胶质瘤Ⅰ级。 2、组织块法成功体外培养该例视神经胶质瘤细胞，初长出来的肿瘤细胞以梭形、圆形及椭圆形为主。细胞贴壁生长，消化后的瘤细胞呈圆或椭圆形。体外培养传至第3代时，经免疫组化鉴定，视神经胶质瘤细胞已占98％以上。肿瘤细胞传代至第十代后，出现细胞生长缓慢甚至停滞和凋亡等。透射电镜可见瘤细胞呈梭形细胞为主，细胞内有胶质丝，免疫组化GFAP、VIM染色瘤细胞阳性。 3、转染后的视神经胶质瘤细胞可稳定、反复传代，MTT比色法对转染前的与转染后的第三代瘤细胞相比较检测结果显示，转染前的视神经胶质瘤细胞可见瘤细胞生长缓慢；转染后的细胞前四天生长增殖较快，第五天开始出现平台期。透射电镜显示转染后的视神经胶质瘤细胞中存在病毒颗粒，分布于细胞内，以胞核内为主。免疫组化染色GFAP、VIM、SV40大T抗原均阳性表达。RT-PCR结果SV40大T抗原条带阳性，证明成功转染视神经胶质瘤细胞。 4、用转染后的视神经胶质瘤细胞和人黑色素瘤细胞OCM-1进行三维培养，7天后HE染色光学显微镜观察，看到网格样的血管拟态结构。RT-PCR检测血管内皮相关基因表达显示转染后的视神经胶质瘤细胞与OCM-1均表达血管内皮相关基因，而对照组人视网膜色素上皮细胞株D405则无血管相关内皮基因表达。 5、转染后的视神经胶质瘤细胞在无血清限制性分化培养基中，经倒置相差显微镜观察，均出现了悬浮的神经球样干细胞团，免疫组化Nestin阳性、GFAP阴性；荧光染色共聚焦显微镜观察Nestin阳性，RT-PCR结果Nestin、Nestin-P、BMI-1、Pax-6、Rxp、CH10P呈阳性表达，证明为肿瘤干细胞。 四、研究结论： 1、人视神经胶质瘤细胞可以原代培养并能传代，但传代次数有限。 2、SV40大T抗原能够成功转染视神经胶质瘤细胞，细胞生长能力增强，有望建立瘤细胞系。 3、SV40大T抗原转染后建立的视神经胶质瘤细胞系中，瘤细胞能具备形成血拟态的潜能。 4、SV40大T抗原转染后所获得的视神经胶质瘤细胞内存在着肿瘤干细胞。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章实验材料

第二章实验方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章全文总结

第六章问题与展望

参考文献

在学期间发表的文章

致谢