骨髓间质干细胞与新型仿生复合支架用于骨组织工程的研究

摘要

第一部分　成人骨髓间质干细胞体外分离、扩增、鉴定及成骨诱导分化体系的建立 1.1 目的 分离、扩增、鉴定成人骨髓间质干细胞(hMSCs)，并建立体外成骨诱导分化体系，为组织工程骨的研究奠定基础。 1.2 方法 取健康的成人骨髓，Ficoll-Hypaque密度离心法分离，含10％FCS的L-DMEM培养液贴壁培养，3d后全量换液除去未贴壁细胞。培养至14～18d细胞接近融合，接近融合的细胞用胰酶室温消化，按1：3比例传代，含10％FCS的L-DMEM培养液培养。取第3～5代贴壁细胞用10mg／L胰岛素，1μmol／L地塞米松，0.5mmol／L 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)，100mmol／L吲哚美辛的条件定向诱导贴壁细胞向脂肪细胞分化，对照组用L-DMEM完全培养液培养，观察形态学的变化。在诱导的第14d实验组与对照组均用油红O染色。用10-7mol／L地塞米松，10mmol／L β-甘油磷酸钠，50μg／ml维生素C(Vitamin C)的条件定向诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。对照组用L-DMEM完全培养液培养。观察形态学变化，在诱导的第14d实验组与对照组均用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色，在诱导的第21d实验组与对照组均用茜素红染色。 1.3结论 1.3.1成功地进行了成人骨髓来源的hMSCs的分离、扩增及鉴定。 1.3.2在含地塞米松、β-甘油磷酸钠、Vitamin C的成骨诱导液的作用下，hMSCs可在体外定向分化为成骨细胞，其成骨过程与体内成骨细胞有相似的形态和生长特点。 第二部分　人的骨髓间质干细胞与新型仿生复合支架体外相互作用的研究 2.1目的 评价hMsCs在新型BG-COL-HYA-PS复合支架上的粘附，增殖，迁移及成骨分化能力，为进一步MSCs与BG-COL-HYA-PS支架体外构建组织工程骨及体内修复骨缺损的研究提供依据。 　　2.2方法　　将消化好的20μlP3hMSCs(3×106／ml)细胞悬液接种到BG-COL-HYA-PS复合支架，及58sBG，BG-COL，BG-COL-HYA对照组支架表面，加入L-DMEM完全培养液用于检测细胞形态，粘附，增殖及迁移；加入成骨细胞诱导液用于检测细胞的分化。 细胞材料复合物培养1d，在扫描电镜下观察细胞形态；细胞材料复合物培养0天(6h)，3d，7d，14d，21d用MTT法检测细胞的粘附和增殖；在培养Od(6h)，3d，7d，14d，21d时，各细胞支架复合物用冰冻切片机切成10μm厚的切片(垂直于材料的细胞接种表面，穿过材料的中心)，Hoechst 33344染色20min，在荧光显微镜下观察细胞在材料内部的分布；对于每一张切片，从细胞接种面到材料中部依次分为5个100μm迁移距离带，通过荧光显微镜计数不同时间点每个区域的细胞数，从而对细胞的迁移距离进行定量评估。 细胞支架复合物在成骨诱导液中培养14d时取出，用冰冻切片机切成10gm厚的切片(垂直于材料的细胞接种表面，穿过材料的中心)，加入BCIP／NBT染色液20min，观察ALP染色结果；细胞支架复合物在成骨诱导液中培养3d，7d，14d，21d时，加入A300μl ALP裂解液，超声裂解，提取蛋白。用Alkaline Phosphatase Assay kit检测碱性磷酸酶浓度，用Bio-Rad DC Protein Assaykit检测总蛋白浓度，ALP活性计算为酶浓度与总蛋白浓度之比；成骨诱导后14d，提取细胞总RNA，RT-PCR分析骨桥蛋白(osteopontin，OPN)，ALP，骨钙素(osteocalcin，OC)等成骨基因的表达。 2.3结论 2.3.1无机的58sBG与COL，HYA，PS等有机成分复合能明显提高hMSCs的黏附、生长、迁移及分化为骨组织的能力。 2.3.2仿生BG-COL-HYA-PS复合支架与hMSCs在体外有良好的相互作用。 第三部分　HrGFP基因示踪rMSCs与复合支架体外构建组织工程骨的研究 3.1目的 用绿色荧光蛋白(humanized renillar green fluorescent proteirt，hrGFP)标记大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)，与BG-COL-HYA-PS支架复合培养体外构建组织工程骨，示踪标记细胞在工程化骨体外构建的作用。 3.2方法 分离四周龄SD鼠股骨及胫骨近端，冲洗骨髓后，用直接贴壁法获得原代rMSCs，扩增至第3代用于基因转染。 HrGFP质粒经XL-GOLD菌转化后碱法提取质粒DNA，用293FT细胞包装含hrGFP的Lentiviral Vectors后，获得病毒上清转染rMSCs。 将hrGFP标记的rMSCs(3×106／ml)接种到BG-COL-HYA-PS支架表面，加入L-DMEM完全培养液或成骨细胞诱导液。分别在接种6h，7d，14d荧光倒置显微镜直接观察细胞的形态，粘附及增殖；在培养Od(6h)，7d，14d时，细胞支架复合物被取出，用冰冻切片机将复合物切成10gm厚的切片(垂直于材料的细胞接种表面，穿过材料的中心)，荧光倒置显微镜观察不同时间点细胞在材料内部的分布；成骨诱导后14d，细胞材料复合物行冰冻切片，荧光免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)的表达。 　　　第四部分　HrGFP-rMSCs与复合支架修复大鼠股骨缺损的实验研究 4.1目的 用hrGFP-rMSCs与BG-COL-HYA-PS复合支架在体外构建的组织工程骨修复大鼠股骨骨缺损，以探讨其修复骨缺损的可能性，同时示踪体内移植后rMSCs的作用及转归。 4.2方法 将hrGFP-rMSCs，分别与58SBG，BG-COL,BG-COLHYA, BG-COL-HYA-PS支架复合接种(分别为B／MSC组，BC／MSC组，BCH／MSC组，BCHP／MSC组)，体外成骨诱导14d。另外设置BG-COL-HYA-PS支架未复合细胞组(BCHP组)，相同条件下诱导14d作为对照。 制作成年SD鼠双侧股骨骨缺损模型：股骨中下段1／3，宽3.5mm，长4.5mm，深度达到骨髓的缺损。缺损处或放入支架细胞复合物，或仅放BG-COL-HYA-PS支架，或为空白对照(Empty组)。观察术后局部及全身反应。 术后3d，3周，6周，各组动物行双后肢侧位X线检查；各时间点动物处死后即刻取出双侧股骨，移植物及周围组织石蜡切片行HE染色。显微镜下观察移植物的组织相容性及新骨形成情况。图片输入图文处理软件Image Pro Plus 5.1进行处理，计算新骨牛成面积百分比；3周行石蜡切片Ⅰ型胶原免疫组化染色；术后6周，分离获取整根股骨，另取相同月龄SD鼠正常股骨作为正常对照，行三点弯曲试验检测标本的弯曲刚度(N／mm)。 术后3周将含细胞材料复合物的股骨取出，体视荧光显微镜下观察细胞的分布；细胞材料复合物行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察移植细胞的存活情况。 4.3小结 4.3.1 BG-COL-HYA-PS复合支架在体内有良好的生物相容性及骨传导性； 4.3.2 BG-COL-HYA-PS支架及rMSCs联合移植能明显促进大鼠骨缺损结构及功能恢复； 4.3.3 HrGFP标记的rMSCs在体内至少存活3周并参与新骨的重建。

目录

文摘

英文文摘

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声明

引言

第一部分成人骨髓间质干细胞的分离、扩增、鉴定及成骨诱导体系的建立

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

1.5结论

第二部分人的骨髓间质干细胞与新型仿生复合支架体外相互作用的研究

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三部分HrGFP基因示踪rMSCs与复合支架体外构建组织工程骨的研究

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四部分HrGFP-rMSCs与复合支架修复大鼠股骨缺损的实验研究

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

全文小结

参考文献

附图1

附图2

攻读博士期间发表的论文

致谢