视网膜小胶质细胞在细菌脂多糖诱导的感染性眼内炎中的致病作用

摘要

细菌性眼内炎是眼外伤或内眼手术后常见的致盲性并发症，而视网膜的结构和功能的损害是致盲的主要原因。在感染性眼内炎，感染引起的视网膜炎症可导致血视网膜屏障的破坏、视网膜内大量外周血来源的炎症细胞浸润和视网膜解剖学结构破坏，如感光细胞层皱褶和脱离、或视网膜各细胞层完全溶解崩溃，最终视网膜功能丧失。在感染性眼内炎，导致视网膜功能和结构的破坏的视网膜炎症反应的确切免疫机制目前并不清楚，因而，临床上可有效地抑制视网膜炎症和给视网膜提供神经保护作用的治疗措施相当缺乏。
　　 小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的一种固有的组织型巨噬细胞。最近的研究表明在CNS神经退行性疾病和感染性疾病如脑脓肿、多种病毒和原虫性感染等病理情况下，小胶质细胞被激活并在炎症的发生发展中起着关键性作用，小胶质细胞的激活可导致神经损害。米诺环素(MC)，一种半合成的第二代四环素衍生物，无论是在感染性或非感染性CNS疾病，均可有效抑制小胶质细胞的活性并对神经细胞有保护作用，展示出一种有益的免疫调控潜能。然而，视网膜小胶质细胞在感染性眼内炎中的致病作用和米诺环素能否在眼内细菌性感染引起的宿主免疫炎症性反应的发挥调控作用，目前尚未见相关研究。对感染性眼内炎的宿主和致病菌之间的相互作用的分子和细胞学的机制的进行充分的研究，可为发展新的眼内炎治疗策略提供新的靶向。本研究目标是设计出一种可精确区分视网膜内被激活的视网膜小胶质细胞和外周血来源的浸润炎症细胞的方法，并探讨视网膜小胶质细胞在内毒素诱导的眼内炎中的致病作用；最后，我们对米诺环素在细菌脂多糖诱导的感染性眼内炎的治疗作用进行观察。
　　 第一部分在体标记视网膜小胶质细胞
　　 目的:对视神经横断后的SD大鼠的视网膜小胶质细胞的形态、分布和细胞密度进行观察。
　　 方法:将4-Di-10-ASP染料颗粒填充于视神经鞘内视神经横断面以逆行标记视网膜小胶质细胞。分别在视神经横断后14，28，35，42和56天处死大鼠摘除眼球，视网膜以0X42和TNF-α行免疫组织化学染色后激光共聚焦显微镜下观察。
　　 结果:在视神经横断后14天可发现散在的4Di-10ASP标记的节细胞。至28天节细胞则几乎完全消失，OX-42和4Di-10ASP均呈阳性的小胶质细胞，主要分布于内丛状层(IPL)，节细胞层(GCL)，神经纤维层(NFL)，也可见少量小胶质细胞位于外丛状层(OPL)。小胶质细胞形态上以呈现树枝状突起为主，胞体直径较小。所有4Di-10ASP(+)细胞0X42均呈阳性；在视神经横断后28，35，42和56天，视网膜小胶质细胞计数分别为350.8±14.21；360.2±21.47；336±9.91和341±12.65 cells/mm2,各组间差异无统计学意义。在视神经横断后28-56天内，视网膜内未见TNF-Q阳性细胞。
　　 结论:荧光染料4Di-10ASP可特异性逆行标记全部视网膜小胶质细胞。在视神经横断后28至56天，这些细胞均处于稳定的静止状态。因此，本动物模型可作为动态跟踪观察视网膜小胶质细胞活性和细胞动力学变化的理想平台。
　　 第二部分视网膜小胶质细胞在LPS诱导的眼内炎中的致病作用
　　 目的:观察LPS眼内注射后视网膜小胶质细胞的细胞动力学变化，并探讨其在LPS诱导的感染性眼内炎中的致病作用。
　　 方法:将SD大鼠以4-Di-10-ASP染料颗粒填充于视神经横断面逆行标记视网膜小胶质细胞。在视神经横断后28天，向玻璃体腔内注入LPS以建立感染性眼内炎动物模型。在LPS注射后不同时点处死大鼠摘除眼球，视网膜以OX42、IL-1β、TNF-α行免疫组织化学染色后在激光共聚焦显微镜下观察。
　　 结果:LPS玻璃体腔内注入后3小时，视网膜小胶质细胞主要位于GCL和IPL，此部位的视网膜小胶质细胞的数量较NS对照组(350±11cell/mm2)有较明显的增加(分别为3小时后458±45.6 Cell/mm2和6小时后477±87 Cell/mm2,两组均P<0.05)，而冰冻切片则显示视网膜小胶质细胞主要位于NFL和IPL，在OPL，几乎检测不到视网膜小胶质细胞。视网膜小胶质细胞呈多种形态，由双极状或多分支状变为胞体变大，呈阿米巴样外观，突起变短。此时视网膜小胶质细胞已表达TNF-α和IL-1β。LPS玻璃体腔内注入后3小时，在视网膜小血管内仅可见圆形白细胞(OX42(+)/4-Di-10ASP(-)细胞)开始贴壁并粘附于血管内壁。至LPS玻璃体腔内注入后6小时后，大量炎症细胞已浸润至视网膜内。
　　 结论:在LPS诱导的感染性眼内炎的早期，视网膜小胶质细胞被激活，向视网膜内层迁移，由双极、多分支状的狭长形态变为大胞体、分支粗短的阿米巴样外观，并表达促炎因子TNFα和IL-1β；这些小胶质细胞的迁移和活化发生在外周炎症细胞浸润入视网膜之前，这提示在LPS诱导的感染性眼内炎，视网膜小胶质细胞可能起启动眼内炎症，招募血液中的炎症细胞导致炎症的扩大的关键作用。
　　 第三部分米诺环素对LPS诱导的感染性眼内炎的治疗作用
　　 目的:探讨米诺环素在LPS诱导的感染性眼内炎的治疗作用。
　　 方法:首先建立LPS诱导的SD大鼠眼内炎动物模型。在LPS注射前12小时及其后连续7天每天向上SD大鼠腹腔内注射米诺环素(50mg/Kg溶于0.2ml生理盐水)。在LPS注入后的不同时点，对眼部炎症分别进行临床和组织病理学检查，并测定前房水蛋白质浓度。
　　 结果:在LPS注射后3小时，两组大鼠均在前房出现闪辉和细胞纤维素性渗出。在L，PS眼内注入后12至24小时，两组大鼠LPS诱导的眼内炎症反应均达到高峰，在第3天后迅速减轻。在LPS注射后所有时点，在米诺环素治疗组大鼠可以观察到明显的临床炎症减轻和前房纤维素性渗出减少。炎症细胞计数显示，与对照组比较，米诺环素治疗组浸润至玻璃体腔内的炎症细胞明显减少(在LPS注射后24小时分别为356±55和1125±65.6)。米诺环素治疗组在各时点可观察到前房蛋白浓度轻度下降，但种差异无统计学意义。
　　 结论:米诺环素可明显抑制白细胞的眼内浸润并有效减轻LPS诱导的感染性眼内炎炎症反应，但不能改善血眼屏障的破坏。这些结果进一步证实视网膜小胶质细胞的活化可能是LPS诱导的白细胞眼内浸润起重要作用，视网膜小胶质细胞是启动和扩大LPS诱导的感染性眼内炎的关键因素。而米诺环素，由于同时具有杀灭致病细菌和调控过剧的宿主免疫炎症反应的双靶向特征，在感染性眼内炎的治疗应用上有广阔的前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说：英文缩写索引

声明

前 言

第一部分 在体标记视网膜小胶质细胞

1.1材料和方法

1.2结 果

1.3讨 论

第二部分 视网膜小胶质细胞在LPS诱导的感染性眼内炎中的致病作用

2.1材料和方法

2.2结 果

2.3讨 论

第三部分 米诺环素在LPS诱导的眼内炎的治疗作用

3.1材料和方法

3.2结 果

3.3讨 论

全文总结

问题和展望

附图

参考文献

在读期间写作的论文和获得的基金

致 谢