前列腺特异膜抗原新剪接变异体PSM-F的发现与真核表达载体构建

摘要

研究背景与目的 前列腺特异膜抗原(PSMA)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于前列腺上皮细胞，具有较高的前列腺特异性和膜结合特性，是近年前列腺癌研究的热点之一。PSMA在正常前列腺中低表达，在大多数前列腺癌组织中高表达，并随肿瘤的进展而表达增高，在转移癌及激素不敏感型前列腺癌中表达进一步增高，提示PSMA可能与肿瘤的发生发展相关，是目前公认的前列腺癌诊断及治疗靶标之一。 PSMA存在多种剪接变异现象，目前发现并报道的PSMA剪接变异体己有四个。诸多研究提示，PSMA的选择剪接与前列腺癌的发生发展密切相关。深入该领域的研究有利于揭示前列腺癌的发牛机制，对寻求更加特异有效的前列腺癌诊治靶标具有重要意义。 既往有关PSMA剪接变异的研究多聚焦于对某单一变异体的表达鉴定及临床意义的阐述。由于缺乏系统有效的研究方法和手段，对其剪接机制多样性的认识存在一定的片面性。为了从整体上了解PSMA的剪接变异现象，本研究拟建立以RACE技术为基础的有关PSMA剪接变异体多样性的分析方法，旨在最大程度地发现可能存在的PSMA剪接变异体，并对新发现变异体进行鉴定证实。在此基础上构建其真核表达载体，为后续的相关研究垫定实验基础。 材料与方法 1.在PSMA各变异体的相对公共区序列设计锚定引物，应用RACE技术在LNcap细胞中进行扩增。 2.RACE产物经测序后，应用计算机软件进行测定序列的拼接、比对分析。选取拼接序列的来源RACE片段作为模板，采用重叠PCR进行完整序列的重构。 3.设计重构序列的特异性引物，在LNcap细胞中进行PCR扩增，验证其天然表达。 4.应用ORFfinder程序查找此序列的开放读码框架，设计引物PCR扩增完整ORF序列，并克隆入真核表达载体pcDNA3.0。 结果与讨论 应用RACE技术在LNcap细胞进行扩增，产物经计算机软件拼接分析及重叠PCR重构，我们得到一条不同于以往PSMA各变异体序列的完整新序列。经证实该序列在LNcap细胞天然表达，确认为一种新的PSMA变异体(Genebank号：EF488812)。尽管该新变异体的临床及生物学意义尚有待进一步研究证实，但它的发现无疑证实和丰富了PSMA剪接变异的多样性，为深入研究前列腺癌的发生机制，寻求有效的诊断标志和治疗靶点拓展了思路，提供了新的线索。 在上述研究的基础上，我们构建了PSM-F的真核表达载体pcDNA3.0／PSM-F。新构建的重组子经测序鉴定证实，目的基因与模板序列100％同源，且插入方向及读码框架准确无误，表明PSM-F真核表达载体构建成功。此为PSM-F在真核细胞中的表达及后续相关研究打下了基础。 然而，有关PSMA变异体研究的一个重要方向及内容就是阐明它的临床及生物学意义，以确定其临床及研究中的理论价值与应用前景。而这些又有赖于对其在不同组织来源细胞及不同病理改变前列腺组织中表达差异和生物学功能的了解，以及对不同PSMA变异体之间相互作用及关系的认识。有关工作本实验组正加紧研究，相关结果将另文报道。关于PSMA的选择性剪接机制，也是值得研究者们深入探究的问题，这对于了解前列腺癌的发生发展机制或有裨益。 结论 1.建立了以RACE为基础的PSMA剪接变异体多样性研究的系统分析方法。 2.发现并证实了一种新的PSMA剪接变异体PSM-F。 3.成功构建了PSM-F的真核表达载体，为PSM-F的相关后续研究垫定了基础。

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结论

参考文献

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