倒刺鲃和斑马鱼雌激素受体的克隆鉴定及其在精子发生过程中的功能研究

摘要

雌激素作为一种多效性的类固醇激素，在生殖、心血管疾病、骨质结构、肿瘤发生以及性行为等众多生理过程中起到重要的调节作用。就生殖方面而言，“雌激素”的称谓早已经不能全面和恰当地概括其实质。这种传统的将雌激素(estrogen)视为雌性特有激素的观念，如今受到了严峻的挑战和极大的冲击。雌激素受体和芳香化酶基因敲除后，生殖能力严重受损的雄性小鼠模型的相继建立，把人们对雌激素调控生殖作用的注意力由雌性转移到雄性。越来越多的实验结果表明，雌激素在其受体介导下，直接调节精子发生过程从而影响雄性生殖生理。本研究先后在倒刺鲤中克隆了四种雌激素核受体，在斑马鱼中克隆得到GPR30，并检测它们在雄鱼中的组织分布模式、脑和精巢组织的细胞定位(GPR30)，结合精子发生过程中的受体的差异表达和血清中促黄体激素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)和17β-雌二醇(estradiol-17β，E2)浓度的变化及其在介导内源和外源雌激素诱导生殖细胞凋亡过程中的作用等研究内容，深入探讨了雌激素及其受体在硬骨鱼类雄性精子发生过程中的功能和分子作用机制。主要研究结果如下： 1、本文首次在雄性倒刺鲐中克隆得到了四种雌激素核受体(sdERα1，sdERα2，sdERβ1，sdERβ2)，进化树分析表明，它们分属于ERα和ERβ两种亚型，其中同种亚型的两种异形体受体同源性较高。RT-PCR结果显示，倒刺鳃雄性个体中，四种雌激素受体基因均在中枢神经组织表达。在主要的一些外周组织，β亚型的两种受体亦广泛存在。然而，α亚型的分布则表现出一定的特异性。其中，sdERα1主要在肝脏、肾脏、精巢和肠中表达，而sdERα2集中分布于肝脏、心脏、肾脏、精巢和鳃。实时荧光定量PCR结果表明，四种受体在垂体中的丰度最高，其中α亚型的两个受体随着精巢的发育成熟表达水平也逐渐提高，而β亚型的两个异形体则表现出相反的表达趋势。sdERα1和sdERβ1是精巢组织中存在的两种主要的雌激素受体，其中sdERα1丰度在精巢发育的过程中逐渐增大，sdERβ1的表达则先在精巢发育阶段减弱，然后在精巢成熟阶段显著性增强。四种雌激素受体在脑中的丰度均较低。倒刺鲃的四种雌激素受体基因随着精巢发育成熟，在脑-垂体-性腺生殖轴中表现出各自不同的时序性表达模式，暗示在精子发生过程中，雌激素可能通过不同的核受体直接作用于精巢组织以实现调控雄性生殖的功能。 2、采用异源放射免疫测定(heterologous radioimmunoassay)方法检测了倒刺鲃精巢发育早期、发育晚期和成熟期三个时期雄鱼血清中LH的含量。同时用购自北京北方生物技术研究所的放免试剂盒测定了血清中T和E2的含量。结果发现，在精巢发育期的整个阶段，雄性倒刺鲃血清中LH、T和E2的浓度逐渐上升，到了精巢发育的晚期，血液循环中的LH和T浓度达到较高的水平并一直持续到性腺成熟，但E2浓度始终维持很低水平。 结合四种雌激素受体随精巢发育成熟过程在脑-垂体-性腺生殖轴中的时序性表达模式，我们推测倒刺鲃雄鱼垂体中表达的两种α亚型的雌激素受体可能在E2对LH分泌的反馈(正、负)调节扮演重要角色。 3、结合生物信息学和RACE(cDNA末端快速扩增)技术，在斑马鱼中克隆了一个七次跨膜的G蛋白偶联受体。进化树分析和氨基酸序列多重比对结果表明，该受体蛋白与人类新发现的雌激素膜受体GPR30具有较高的同源性。RT-PCR结果显示斑马鱼GPR30(zfGPR30)在脑和性腺丰度最高，肌肉和肠中次之，而在肝脏和心脏中表达量很低或者没有。运用原位杂交技术发现，zfGPR30在雄性成鱼脑组织的嗅球、端脑皮质部、项盖的室周灰质带、腹侧下丘的室周核区域以及小脑和延脑等部位均有表达；在成鱼的精巢组织中，GPR30主要分布于早期的生殖细胞如精原细胞和精母细胞以及谢尔托立氏(Sertoli)细胞，而在单倍体的精子细胞中检测不到信号，提示七次跨膜的GPR30蛋白可能在斑马鱼早期精子发生过程中发挥作用。 　　4、在瞬时转染zfGPR30-pcDNA3.1真核表达载体的成纤维猴肾(cos-7)细胞中，用3H标记的E2检测斑马鱼GPR30与17p-E2的结合能力，根据Scatchard分析作图计算得出斑马鱼GPR30与17p-E2的亲和常数为4.6nM。c-fos和腺苷酸环化酶基因转录活性分析结果显示，斑马鱼GPR30在各种浓度的17p-E2处理下都不能显著刺激c-fos基因启动子偶联的萤光素酶的表达；而在10-8M 17β-E2浓度下即可显著性地启动带有腺苷酸环化酶应答元件的启动子偶联的萤光素酶基因的表达。结果首次证实了低等脊椎动物鱼类存在功能性的雌激素膜受体GPR30。 5、分别用17β-E2、雌激素核受体拮抗剂ICI182，780和芳香化酶抑制剂Fadrozole短期(10天)浸泡处理成年雄性斑马鱼。组织学检测结果表明，处理后的精巢组织结构并未发生明显变化。进一步的TUNEL法细胞凋亡检测结果显示，外源性雌二醇能诱导精子细胞或精子的明显凋亡，而核受体拮抗剂ICI182，780和芳香化酶抑制剂Fadrozole则除了引起晚期生殖细胞的凋亡外，还对早期的精母细胞起凋亡促进作用。实时荧光定量PCR分析发现，相对于对照组，各个处理组zfERβ1无明显变化，17β-E2处理组的zfERα表达显著性降低；ICI182，780处理组的zfERβ2丰度显著性升高：17p-E2和Fadrozole处理组的zfGPR30表达明显降低。在检测的斑马鱼凋亡相关基因中，17β-E2处理的精巢组织中Fas和FasL mRNA表达显著提高；ICI182，780处理的精巢组织中bax、Fas和p73mRNA表达显著提高；Fadrozole处理的精巢组织中Fas和p73 mRNA表达显著提高，其余基因对照与处理组变化不明显。 结果提示，17β-E2、ICI182，780和Fadrozole通过Fas途径引发精子细胞的凋亡，而后两者同时通过p73途径引起精子发生早期精母细胞的凋亡。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪 论

1.精子发生及其激素调节过程

2.受体介导的雌激素效应

3.雌激素及其受体对精子发生过程的影响

4.研究的主要目的和意义

5.特色和创新点

第1章倒刺鲃雌激素核受体的克隆及其序列和表达模式分析

1.前言

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2倒刺鲃四种雌激素核受体基因的克隆

2.3序列分析

2.4表达模式分析

3.结果

4.讨论

第2章倒刺鲃精子发生过程中内分泌调控研究

1.前言

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2组织学切片确定精巢的发育阶段

2.3雄性倒刺鲃精巢发育过程中血清LH含量的测定

2.4雄性倒刺鲃精巢发育过程中血清T和E2含量的测定

2.5数据分析

3.结果

4.讨论

第3章斑马鱼雌激素受体基因的克隆及其序列和表达模式分析

1.前言

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2斑马鱼三种雌激素核受体基因的克隆

2.3核受体的基因结构分析

2.4斑马鱼雌激素膜受体GPR30基因的克隆

2.5 GPR30 cDNA序列及其基因结构分析

2.6 GPR30基因表达模式分析

3.结果

4.讨论

第4章斑马鱼雌激素膜受体GPR30的功能鉴定

1.前言

2.材料和方法

2.1实验材料

2.2重组斑马鱼GPR30真核表达载体的构建

2.3细胞转染与表达检验

2.4斑马鱼GPR30与estradi01-17β的结合率测定

2.5斑马鱼GPR30介导的estradi01-17β激活下游信号通路的研究

3.结果

4.讨论

第5章斑马鱼精子发生过程中雌激素对生殖细胞凋亡调控及分子机理研究

1.前言

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2 17β-E2、ICI182,780和Fadrozole浸泡处理斑马鱼

2.3处理斑马鱼精巢的组织学切片观察

2.4处理斑马鱼精巢组织学切片的细胞凋亡分析

2.5处理斑马鱼精巢组织中雌激素受体和凋亡相关基因表达差异分析

3.结果

4.讨论

结语

参考文献

附 录

后 记