脊髓NMDA受体-JNK途径介导吗啡耐受的研究

摘要

吗啡是临床常用的一种阿片类镇痛药，被广泛用于治疗各种急慢性疼痛，但是，长期使用会产生药物耐受，并具有成瘾性，使其应用受到很大的限制。
　　 近年，MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在吗啡耐受中的作用日益受到重视。在体和离体的实验证实，急性和慢性吗啡耐受可以上调ERK和p38MAPK的表达；本实验室的研究表明，鞘内慢性注射吗啡可激活脊髓小胶质细胞中的p38 MAPK，p38抑制剂SB203580能显著地拮抗吗啡耐受；提示，ERK和p38 MAPK可能在吗啡耐受中起着重要的作用。与ERK和p38 MAPK在吗啡耐受中的作用的研究相比，有关JNK在吗啡耐受中的作用的报道很少，但是，JNK在多种病理性疼痛的产生和维持中的作用却成为研究热点。多种病理性疼痛，如坐骨神经结扎(SNL)、蜂毒致持续性疼痛、炎症痛等，可明显激活DRG、脊髓等部位的JNK，JNK抑制剂SP600125、D-JNK-1在抑制JNK活性的同时亦减轻病理性疼痛，表明JNK介导了病理性疼痛。有学者推测，吗啡耐受和病理性疼痛的产生机制可能有许多相似之处。在培养的DRG神经元，吗啡慢性刺激可诱导p-JNK显著升高。在吗啡耐受和依赖的动物发现，其脑内JNK3的mRNA水平增加。但是，在吗啡耐受中，脊髓JNK是否被激活？如果被激活，JNK是否介导吗啡耐受？迄今，国内外未见有关报道。
　　 兴奋型氨基酸(excitatory amino acid systems，EAAs)是中枢神经系统重要的神经递质。NMDA受体是一种EAAs受体，由不同亚单位组成四聚体或五聚体，编码这些亚单位的基因分属三个家族，分别命名为NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D)和NR3(NR3A和NR3B)。其中，NR1为必需功能亚基，NR2为调节亚基。NR2B在痛觉信息传递和调制通路(如前脑和脊髓背角浅层)呈优势分布。NMDA受体，特别是NR2B亚单位在痛觉的产生和中枢性痛觉敏化形成中起到重要作用。多年来的研究证实，EAAs和NMDA受体参与吗啡耐受形成。随着对NMDA-R各亚基功能的深入研究，NMDA-R各亚基在吗啡耐受中的作用日益受到重视，但是有关的研究结果很不一致。例如，NR2A和NR2B在吗啡耐受中的表达有增加、减少或不变三种不同结果。因此，需要进一步探讨NMDA受体各亚基，特别是与痛觉调制密切相关的NR2B在吗啡耐受中的表达改变及其作用。
　　 有研究表明，NMDA受体、非NMDA受体等多种神经递质受体的激活耦联MAPK的激活。在原代培养的大鼠纹状体细胞和小脑颗粒细胞，NMDA通过兴奋谷氨酸受体激活JNK，并且JNK的激活被NMDA受体拮抗剂MK-801和AP5所阻断，提示NMDA受体与JNK之间存在兴奋耦连关系。但是，在吗啡耐受过程中，是否存在NR2B与JNK之间的耦连关系？目前国内外尚未见报道，值得深入研究。
　　 胍丁胺是新近发现的一种神经递质和/或神经调质。1996年，Kolesnikov首次报道胍丁胺可以增强吗啡的镇痛作用，抑制其所致的耐受和依赖。然而，目前有关胍丁胺抗吗啡耐受/依赖的作用机制的研究还不够深入，已有研究表明可能与抑制NOS活性，抑制单胺递质(5-HT，NE，DA等)的释放，抑制AC-cAMP信号转导通路等有关。胍丁胺抗吗啡耐受/依赖的受体机制不甚清楚，有学者认为通过咪唑啉受体介导，也有学者认为通过α2-R介导其拮抗吗啡耐受和依赖作用。有研究指出，胍丁胺具有拮抗NMDA受体的作用，并能竞争性地抑制MK-801与NMDA受体的结合，但是，胍丁胺是否通过NMDA受体而产生抗吗啡耐受作用，国内外未见报道。
　　 锌是一种机体必需的微量元素，在中枢神经系统广泛分布，约有10％的Zn2+以自由态存在于一小部分神经元轴突终末的突触小泡内，这类神经元被称为含锌神经元(zinc enriched neuron，ZEN)。游离Zn2+主要分布于端脑(特别是海马)和脊髓背角浅层。这些以囊泡形式储存的Zn2+往往与其他神经递质(谷氨酸、甘氨酸、GABA)共存于ZEN，在一定的刺激下，Zn2+将伴随着这些神经递质一同释放至突触间隙，并且具有调节递质释放和调节突触后受体(如NMDA、AMPA、GABA以及甘氨酸受体)功能的作用，发挥类似神经递质的功能。在NMDA受体上存在高亲和性和低亲和性的Zn2+结合位点，Zn2+与谷氨酸的联合释放可能直接参与受体介导的兴奋性突触后电流的调节。
　　 近年研究证实，脊髓游离Zn2+在伤害性信息传递中发挥重要的作用。鞘内注射Zn2+具有镇痛作用，能够减缓神经损伤或外周炎症所致的痛觉过敏，而EDTA则加重痛觉过敏。探讨游离Zn2+在吗啡耐受和依赖中的作用也有少量报道。在吗啡依赖小鼠模型，脑组织Zn2+含量降低；鞘内注射Zn2+拮抗吗啡急性耐受的形成，减少戒断症状的出现。饮食中缺锌，吗啡的镇痛作用减弱。但是，关于吗啡耐受时，海马和脊髓游离Zn2+含量是否发生变化以及NMDA受体在其中的作用，迄今，国内外未见报道。
　　 为了进一步探讨吗啡耐受机制，本文在本实验室原有的研究基础上，旨在探讨以下内容：1.吗啡耐受对脊髓JNK表达和NMDA受体NR2B亚基表达的影响，并探讨其在吗啡耐受中的作用；2.吗啡耐受对脊髓和海马Zn2+含量的影响，并探讨其在吗啡耐受中的作用；3.探讨胍丁胺抗吗啡耐受的作用机制，是否与影响吗啡耐受时脊髓JNK、NMDA受体NR2B亚基，脊髓和海马Zn2+含量的变化有关。4.探讨NMDA受体拮抗剂MK-801抗吗啡耐受的作用机制，是否与影响吗啡耐受时脊髓JNK、NMDA受体NR2B亚基、脊髓和海马Zn2+含量的变化有关。本研究有助于深入阐明吗啡耐受及抗吗啡耐受机制，特别是对于深入阐明脊髓NMDA受体NR2B-JNK途径在吗啡耐受中的作用及胍丁胺与MK-801(NMDA受体拮抗剂)抗吗啡耐受中的作用具有较重要的理论意义与应用价值。
　　 第一章脊髓NMDA受体-JNK途径在吗啡耐受中的作用
　　 本实验采用Trujillo K.A.介绍的方法，建立慢性吗啡耐受大鼠模型。采用热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果。采用免疫组织化学染色法检测脊髓p-JNK和NR2B的分布和表达，采用免疫印记法(Western blot)检测脊髓JNK、p-JNK和NR2B的表达。
　　 结果表明，慢性吗啡注射9d后，吗啡的镇痛作用明显下降，表明吗啡耐受形成；Western blot的结果显示，吗啡耐受大鼠脊髓JNK的表达没有改变，但是p-JNK和NR2B表达增多，表明p-JNK表达的增加并非由于总的JNK水平的增加所致，而是由于JNK的磷酸化水平增加所致，即吗啡耐受伴随p-JNK的激活和NR2B的上调。免疫组织化学染色结果与Western blot结果相一致，并且p-JNK和NR2B免疫反应产物仅分布于脊髓背角浅层。
　　 为了进一步探讨NMDA受体NR2B-JNK途径在吗啡耐受中的作用，本研究观察了MK-801对上述变化的影响，结果表明，MK-801(0.1 mg/kg)本身对痛阂无影响，但与吗啡合用具有显著的抗吗啡耐受作用；MK-801在抗吗啡耐受的同时，明显地抑制吗啡耐受引起的脊髓背角浅层NR2B表达的增多，还显著地抑制吗啡耐受对脊髓背角p-JNK的上调作用。提示JNK位于NMDA受体的下游，MK-801可通过抑制脊髓NR2B-JNK途径而产生抗吗啡耐受作用。
　　 为了探讨胍丁胺抗吗啡耐受机制，本研究观察了胍丁胺对上述变化的影响，结果表明，胍丁胺(10 mg/kg)本身对痛阈无影响，但与吗啡合用具有显著的抗吗啡耐受作用；胍丁胺与吗啡合用能显著抑制吗啡耐受引起的脊髓p-JNK表达增多和NR2B表达的上调。此作用机制与MK-801的抗吗啡耐受机制相似，提示胍丁胺可能通过抑制NMDA受体，进而抑制p-JNK信号途径而发挥抗吗啡耐受作用。
　　 第二章脊髓和海马Zn2+在吗啡耐受中的作用
　　 越来越多的证据表明Zn2+参与痛觉的调制，本实验旨在探讨Zn2+在吗啡耐受中的作用。吗啡耐受模型建立和动物分组同前，采用原子吸收光谱法测定脊髓和海马Zn2+含量。结果表明，吗啡耐受导致脊髓和海马Zn2+含量降低；胍丁胺(10 mg/kg)或MK-801(0.1 mg/kg)本身不影响脊髓和海马Zn2+含量，但是，胍丁胺或MK-801与吗啡合用拮抗吗啡耐受的同时，阻断并翻转吗啡耐受时脊髓和海马Zn2+含量的降低。提示，脊髓和海马Zn2+含量降低参与吗啡耐受形成机制，MK-801和胍丁胺可通过逆转Zn2+含量降低而产生抗吗啡耐受作用。
　　 结论:
　　 1.本文首次证实，慢性吗啡耐受可激活脊髓JNK，使JNK磷酸化水平增加；
　　 2.慢性吗啡耐受可上调脊髓NR2B；
　　 3.首次证实，吗啡耐受时脊髓和海马组织中Zn2+含量明显减少；
　　 4.NMDA受体拮抗剂MK-801不仅可以显著地抑制吗啡耐受，而且可以显著地抑制吗啡耐受时脊髓JNK的磷酸化、脊髓NR2B的上调及脊髓与海马Zn2+含量的减少；提示吗啡耐受时，脊髓NR2B可能是JNK通路的上游，脊髓NR2B-JNK通路及脊髓和海马Zn2+含量改变参与MK-801的抗吗啡耐受机制；
　　 5.本文率先证实，胍丁胺具有类似于MK-801的抗吗啡耐受作用，其不仅可以显著地抑制吗啡耐受形成，而且可以显著地抑制吗啡耐受时脊髓JNK的磷酸化、脊髓NR2B的上调和脊髓与海马Zn2+含量的减少，这可能是其抗吗啡耐受的机制之一；

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论文说明：中英文缩略词表

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前 言

第一章 脊髓NMDA受体-JNK途径在吗啡耐受中的作用

1.1 引 言

1.2 材料与方法

1.3 结 果

1.4 讨论

1.5 小 结

1.6 参考文献

第二章 脊髓和海马Zn2+在吗啡耐受中的变化

2.1 引 言

2.2 材料与方法

2.3 结 果

2.4 讨 论

2.5 小 结

2.6 参考文献

结 论

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