透明质酸对脂肪干细胞增殖和分化的影响

摘要

成体干细胞(adult stem cells，ASCs)分布广泛、增殖力强且具有多向分化潜能，一直是组织工程“种子细胞”研究的热点。其中，以骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)研究最多，应用最广。但其纯化率较低且数量有限，难以满足临床应用的需求；取材时对机体造成的创伤较大；而且骨髓中干细胞的比例、增殖能力都会随年龄的增长和骨质疏松的发生逐渐下降，因此探索一种新的组织工程“种子细胞”十分必要。脂肪组织再生能力强，体内储量丰富，取材创伤小，细胞可大量获取，有望成为最重要的种子细胞来源库。自2001年Zuk等在脂肪组织中发现具有多向分化潜能的、成纤维细胞样的干细胞以来，相继在包括人类在内的多个物种的研究结果表明其具有多向分化能力。脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)有望成为组织工程的“种子细胞”之一。 透明质酸(hyaluronic acid，HA)是近年来发现的大分子酸性粘多糖，广泛存在于人体内，譬如它是颞下颌关节滑液和关节软骨基质的重要成分，以钠盐的形式存在，即透明质酸钠(sodium hyaluronate，SH)，起润滑关节的作用。透明质酸可减小组织间的摩擦，缓冲咀嚼对关节软骨的压力，营养软骨，保护受损的软骨细胞，同时具有镇痛止血的效果。颞下颌关节紊乱病患者滑液中透明质酸的含量明显减少，软骨细胞及滑膜细胞受损程度明显增加。另外有研究表明透明质酸可以增强体外培养的关节软骨细胞及滑膜细胞的分泌功能并可延长其寿命。 众所周知，干细胞在经体外长期培养后，其增殖活性和分化能力都会有所降低。虽然ADSCs在体外传代能力较BMSCs强，但随着传代的增加，其增殖活性和分化能力也会有所降低。迄今为止，尚无一种可靠的方法可以促进ADSCs增殖和分化。本实验以小型猪ADSCs为实验细胞，透明质酸为作用物质，检测透明质酸对体外培养的小型猪ADSCs增殖和分化潜能的积极影响，并进一步探索一种较为理想的延长体外培养干细胞寿命及增强其分化能力的手段。 第一部分 透明质酸对脂肪干细胞增殖活性的影响 目的: 1.研究透明质酸对体外培养的小型猪ADSCs增殖活性的影响，为组织工程种子细胞寿命的延长奠定理论基础和实验依据。 2.探索增强体外培养小型猪ADSCs增殖活性的透明质酸的最适宜浓度。 方法： 实验分组：A．对照组(基础培养基)；B．低浓度组(基础培养基+HA0.01mg/ml)：C．中浓度组(基础培养基+HA 0.1mg/ml)；D．高浓度组(基础培养基+HA 1.0mg/ml)。 实验步骤：3-5代小型猪ADSCs体外培养1周，消化传代接种至24孔板上，培养1天，倒置显微镜下观察细胞形态。分别加入基础培养基、含不同浓度透明质酸的培养基，培养3、7、14、21天观察细胞形态；传代检测传代后细胞的生长情况；同时MTT法检测其生长增殖情况并绘制生长曲线。本实验数据值以-X±S表示，多组间比较采用重复测量资料的方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验进行统计学分析，统计软件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1.透明质酸作用于ADSCs后，细胞形态、生长曲线等发生改变，增殖活性受到影响。 2.各实验组均可在第3天观察到细胞形态发生变化。高浓度组细胞成簇状生长，不能完全伸长，细胞呈多突起星形。低、中浓度组细胞形态较好，呈典型的长梭形(成纤维细胞样)。14天及21天时细胞形态及数量发生明显差别，高、低浓度组培养瓶中出现一些杂质细胞及脂肪细胞，胞质内可见脂滴，部分细胞形态呈多角形或圆形，细胞生长缓慢；中浓度组及对照组细胞形态仍较好，生长良好。 3.细胞传代后贴壁时间组间有差异；中浓度组细胞贴壁最早，贴壁时间约为4小时。高、低浓度组的贴壁时间均长于对照组。 4.MTT法绘制生长曲线结果显示各组ADSCs在传代后均经历潜伏期、对数生长期和平台期；总体来说，中浓度组细胞生长最快，高浓度组细胞生长最慢，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，但低浓度组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 不同浓度的透明质酸对ADSCs的增殖作用不同，当培养液中透明质酸的浓度为0.1mg/ml时，对ADSCs的生长增殖具有促进作用；透明质酸浓度为1mg/ml时，降低ADSCs的增殖活性；浓度为0.01mg/ml时，与对照组比较，无明显差异。 第二部分 透明质酸对脂肪干细胞分化能力的影响 目的： 1.研究透明质酸对体外培养的小型猪ADSCs分化能力的影响，为组织工程种子细胞分化能力的提高奠定理论基础和实验依据。 2.探索增强体外培养小型猪ADSCs分化能力的透明质酸的最适宜浓度。 方法： 实验分组：A．对照组(传统诱导培养基)；B．低浓度组(传统诱导培养基+HA 0.01mg/ml)；C．中浓度组(传统诱导培养基+HA 0.1mg/ml)；D．高浓度组(传统诱导培养基+HA 1.0mg/ml)。 实验步骤：3-5代小型猪ADSCs体外培养1周，消化传代接种至24孔板，培养1周，倒置显微镜观察细胞形态。分组加入传统诱导培养基，含高、中、低浓度透明质酸的诱导培养基，培养3、7、14、21天观察细胞形态；培养14天后油红O、苏丹黑B染色鉴定成脂诱导效果；Von kossa、茜素红染色及ALP活性检测鉴定成骨诱导效果。碱性磷酸酶定量检测数据值以-X±S表示，多组间比较采用重复测量资料的方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验进行统计学分析，统计软件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1.透明质酸作用于ADSCs后，其仍保持向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。 2.加入各组成脂诱导培养基后，所有组均可在第3天观察到细胞形态变为短梭形、椭圆形，于诱导的第7天开始细胞胞质内有脂滴形成，以后逐渐增多。油红。及苏丹黑B染色结果显示高浓度组脂滴形成效率明显高于低、中浓度组，低、中浓度组又高于对照组。 3.加入各组成骨诱导培养基后，所有组均可在第3天观察到细胞形态变为多角形，于诱导的第5天开始细胞呈集簇状生长。Von kossa、茜素红染色及ALP染色结果显示高浓度组矿化结节形成效率明显高于对照组，低、中浓度组略高于对照组，ALP活性检测结果显示差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 透明质酸作用于成脂诱导、成骨诱导的ADSCs后，细胞形态发生改变，分化效率受到影响。实验中三个浓度的透明质酸对体外培养的ADSCs的成脂、成骨分化能力均具有增强作用；透明质酸浓度为1.0mg/ml时，对ADSCs的增强作用最明显。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 透明质酸对脂肪干细胞增殖活性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 透明质酸对脂肪干细胞分化能力的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

总结与展望

参考文献

实验附图

附录

致谢